陳 彭，黃永鋒，趙 斌，張 宏，薛亞妮，朱 江

腦梗死是人體腦組織內(nèi)血管因各種因素堵塞，而導(dǎo)致血液難以通暢運(yùn)行，使腦組織缺血、缺氧，是中老年人群中的高發(fā)疾病[1]。 腦梗死也稱缺血性腦卒中(cerebral ischemic stroke，CIS)，是臨床常見的腦血管疾病，其致死、致殘率極高，在我國(guó)急性缺血性卒中占全部卒中的60%～80%[2]。腦梗死的發(fā)病率逐年增加，大部分病人因就醫(yī)不及時(shí)，而錯(cuò)過靜脈溶栓治療時(shí)機(jī)，因此，時(shí)間窗外的有效治療和干預(yù)成為目前研究的焦點(diǎn)。腦梗死病因多，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，遺傳、家庭因素的相互作用是本病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。急性腦血栓形成時(shí)，血小板的活化、黏附和聚集是最重要的病理過程，因此，抗血小板聚集的藥物阿司匹林在臨床上被廣泛應(yīng)用于腦血管疾病的Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)預(yù)防，近年來，研究證實(shí)，許多病人對(duì)抗血小板聚集治療藥物的反應(yīng)存在個(gè)體差異，導(dǎo)致阿司匹林抵抗(aspirin resistance，AR)的可能性增加，有研究提示阿司匹林抵抗的可能影響因素包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、2型糖尿病、合并用藥等[3]。臨床上許多病人盡管已規(guī)律服用阿司匹林，但仍會(huì)發(fā)生急性腦血栓，即發(fā)生阿司匹林抵抗[4]，阿司匹林抵抗的確切定義并沒有完全統(tǒng)一，其主要包括“臨床型阿司匹林抵抗”和“生化型阿司匹林抵抗”兩個(gè)方面[5]。阿司匹林抵抗的發(fā)生機(jī)制限制了其臨床效果，但其具體機(jī)制尚未明確[6]。

血小板在急性腦梗死的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，目前有研究發(fā)現(xiàn)微小RNA與血小板活化密切相關(guān)。Willeit等[7]發(fā)現(xiàn)增加阿司匹林的劑量，血小板抑制效率可以增加，而血小板抑制效率增加進(jìn)一步能夠引起血漿miR-126和miR-223的減少。因此，循環(huán)miRNA可以成為新的血小板激活的生物學(xué)標(biāo)志物[8]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月—2018年12月于我院神經(jīng)內(nèi)科就診的急性缺血性腦卒中病人58例為病例組，病歷資料均完整，診斷全部符合2010年中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南標(biāo)準(zhǔn)。其中男31例，女27例，年齡39～79歲，平均年齡62歲。選取同期60名非腦梗死、心肌梗死的健康體檢者作為對(duì)照組，其中男34名，女26名，年齡40～78歲，平均年齡59歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。用全血電阻法將58例急性腦梗死病人分為阿司匹林抵抗組和阿司匹林敏感組，其中阿司匹林抵抗組病人18例，阿司匹林敏感組病人40例。受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和設(shè)備 Trizol總RNA 提取試劑盒購(gòu)買于美國(guó) Invitrogen 公司，逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒均購(gòu)買于大連寶生物工程有限公司，miR-223及內(nèi)參引物均由上海生工公司設(shè)計(jì)合成，花生四烯酸(AA)和二磷酸腺苷(ADP)均為美國(guó)CHRONO-LOG試劑，ABI實(shí)時(shí)熒光定量PCRs儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，血小板分析儀是美國(guó)CHRONO-LOG560血小板分析儀。

1.3 方法

1.3.1 總RNA提取和定量 按照Trizol(TaKaRa China)試劑盒說明書提取病例組及對(duì)照組外周血中總RNA，利用紫外分光光度儀檢測(cè)所有RNA提取液的吸光度值(OD值)，進(jìn)一步檢測(cè)RNA溶液的濃度和純度，最后進(jìn)行RNA定量。A260/A280>1.8，方可用于后續(xù)檢測(cè)。

1.3.2 miR的逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 先在反應(yīng)管中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再取上述反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按照RT-PCR(TaKaRa China)說明書，對(duì)所有樣品設(shè)3復(fù)孔，總反應(yīng)體系為20 μL，ABI7500 System反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃、30 s，延伸95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40個(gè)循環(huán)。再進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。以miR-16作為內(nèi)參基因，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算病例組及對(duì)照組外周血中miR-223的表達(dá)水平。

1.3.3 血小板聚集率的檢測(cè) 病例組病人規(guī)律清晨空腹服用阿司匹林腸溶片(拜阿司匹林，拜爾醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)) 100 mg，每日1次，1周后用AA、ADP兩種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后檢測(cè)血小板聚集率。對(duì)照組不服用阿司匹林。3.2%枸櫞酸鈉防凝全血0.5 mL，用生理鹽水1∶1稀釋，放在預(yù)熱位置預(yù)熱5 min，放入鉑金電極，調(diào)零，按下CALIBRATE按鈕調(diào)到50 Ω，加入上述兩種誘導(dǎo)劑(AA 10 μL，ADP 10 μL)，5 min后停止，儀器會(huì)自動(dòng)計(jì)算出血小板的最大聚集率。

2 結(jié) 果

2.1 兩組外周血中miR-223表達(dá)水平比較 急性腦梗死病人miR-223相對(duì)表達(dá)量為1.333 1±0.124 2，對(duì)照組miR-223的相對(duì)表達(dá)量為0.709 7±0.059 6，急性腦梗死病人外周血中miR-223的相對(duì)表達(dá)量較健康體檢者升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.00 1)。詳見圖1。

圖1 兩組miR-223表達(dá)水平比較

2.2 阿司匹林抵抗組與阿司匹林敏感組miR-223表達(dá)水平比較 阿司匹林抵抗發(fā)生率為31%。阿司匹林抵抗組miR-223的相對(duì)表達(dá)量為2.407 9±0.217 9，阿司匹林敏感組miR-223的相對(duì)表達(dá)量為0.976 5±0.079 8，阿司匹林抵抗組外周血中miR-223的相對(duì)表達(dá)量較阿司匹林敏感組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.00 1)。詳見圖2。

圖2 阿司匹林抵抗組與阿司匹林敏感組miR-223表達(dá)水平比較

3 討 論

腦卒中主要分為出血性和缺血性兩大類型，二者在發(fā)病機(jī)制、病理生理機(jī)制以及臨床康復(fù)和預(yù)后等方面均有明顯差異[9-10]。我國(guó)腦卒中每年新發(fā)病例大約200萬人次，因腦卒中死亡的病人高達(dá)150萬人，帶病生存的病人中近70%伴有不同程度的后遺癥[11]，目前我國(guó)腦卒中病人近700余萬人，其中60%～80%為缺血性卒中，有文獻(xiàn)報(bào)道缺血性腦卒中的發(fā)病率仍在以每年8.7%的速率增長(zhǎng)[12]。盡管病人規(guī)律口服阿司匹林，仍會(huì)發(fā)生急性腦血栓，因此，阿司匹林抵抗的概念逐漸引起大家的關(guān)注。Gum[13]指出病人靜脈血加入阿司匹林處理后采用ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率≥70%或采用AA誘導(dǎo)的血小板聚集率≥20%的標(biāo)本即為阿司匹林抵抗，反之為非阿司匹林抵抗。因此，更有效地治療急性腦梗死成為重中之重。

miRNA是一類非編碼的微小RNA，其生成經(jīng)歷了原始轉(zhuǎn)錄本、前體、成熟體3個(gè)過程，最終的成熟體為19～24堿基(nt)大小，成熟體能夠與靶miRNA 3′端非編碼區(qū)特異性結(jié)合，然后在翻譯和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)[14]。miRNA在腦梗死的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[15]。有報(bào)道顯示血液中的miRNAs，也就是循環(huán)miRNA水平與腦梗死相關(guān)[16]，一些特定的血小板微小RNA與血小板的活性密切相關(guān)，血小板中存在大量miRNA，可以通過作用靶mRNA而進(jìn)一步調(diào)節(jié)靶蛋白的表達(dá)，影響血小板的黏附、聚集、釋放等生物活性[17]。

本研究應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)急性腦梗死病人與健康體檢者外周血中miR-223的表達(dá)水平，急性腦梗死病人miR-223的相對(duì)表達(dá)量為1.333 1±0.124 2，健康對(duì)照組病人miR-223的相對(duì)表達(dá)量為0.709 7±0.059 6，急性腦梗死病人外周血中miR-223的相對(duì)表達(dá)量較健康體檢者升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.00 1)。miR-223在血小板中含量非常豐富[18]。根據(jù)本研究結(jié)果推測(cè)miR-223可能與急性腦血栓的形成密切相關(guān)。有研究指出miR-223可能進(jìn)一步參與血小板對(duì)藥物的反應(yīng)性[19-20]。本研究將58例急性腦梗死病人分為阿司匹林抵抗組和阿司匹林敏感組，阿司匹林抵抗組miR-223相對(duì)表達(dá)量為2.407 9±0.217 9，阿司匹林敏感組miR-223的相對(duì)表達(dá)量為0.976 5±0.079 8，阿司匹林抵抗組miR-223的相對(duì)表達(dá)量較阿司匹林敏感組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.00 1)。因此，推測(cè)miR-223在急性腦梗死病人外周血中高表達(dá)可能與急性腦梗死病人服用阿司匹林期間出現(xiàn)耐藥存在密切關(guān)系。后續(xù)將會(huì)進(jìn)一步研究miR-223的下游靶基因，爭(zhēng)取從遺傳角度為臨床上出現(xiàn)阿司匹林抵抗的急性腦梗死病人提供新的治療靶點(diǎn)，尋找新的治療方案。