凡軍民， 宋 剛， 張 萍， 李 靜

（江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 江蘇 句容 212400）

酶法提取茅蒼術(shù)多糖工藝條件研究

凡軍民， 宋 剛， 張 萍， 李 靜

（江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 江蘇 句容 212400）

目的 確定酶法提取茅蒼術(shù)多糖的最佳工藝條件。方法 采用響應(yīng)面分析法研究各因素對(duì)酶法提取茅蒼術(shù)多糖提取率的影響。 結(jié)果 提取的最佳工藝條件為： 纖維素酶加量 0.32%、 酶解溫度 53 ℃、 酶解時(shí)間 92 min、 液料比23 ∶1。 結(jié)論 在此最佳條件下， 茅蒼術(shù)多糖的提取率為 35.78%， 采用纖維素酶水解能顯著提高茅蒼術(shù)多糖提取率。

纖維素酶；茅蒼術(shù)；多糖；提??；響應(yīng)面分析法

茅蒼術(shù) Atractylodes lancea （ Thunb.） DC.也稱(chēng)南蒼 術(shù)，系菊科蒼術(shù)屬多年生草本植物。江蘇句容茅山為其道地產(chǎn)區(qū)， 因而得名茅蒼術(shù)。 據(jù) 《神農(nóng)本草經(jīng)》 記載［1］， 茅蒼術(shù)性溫，味甘、苦；歸脾、胃、肝經(jīng)；具有燥濕健脾、祛風(fēng)散寒、明目的功效。茅蒼術(shù)中主要含有揮發(fā)油、多糖等活性成分， 國(guó)內(nèi)外研究表明［2-5］， 茅蒼術(shù)具有抗?jié)儭?抗心率失常、降血壓、利尿、保肝、抗炎、抗菌、抗缺氧、中樞抑制及推動(dòng)胃腸道蠕動(dòng)等作用。近年來(lái)有報(bào)道茅蒼術(shù)多糖具有腸免疫活性、 抗假絲酵母菌感染等作用［6-7］。 酶法用于中藥有效成分提取，能縮短提取時(shí)間，保持有效成分藥效，提高有效成分的提取率，且操作簡(jiǎn)便，對(duì)設(shè)備要求不高，條件溫和，在中藥的有效成分提取中有較大的應(yīng)用潛力。本研究采用響應(yīng)面分析法建立了茅蒼術(shù)多糖纖維素酶酶解的工藝，為進(jìn)一步研究茅蒼術(shù)的活性與應(yīng)用提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 材料 茅蒼術(shù)根莖， 采自江蘇省句容市茅山地區(qū)。

1.2 試劑 纖維素酶 （酶活力≥1.5 ×105U/g， 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）， 葡萄糖、 濃硫酸、 苯酚、 3，5-二硝基水楊酸、亞硫酸鈉、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉均為分析純。

1.3 儀器 DHG-9143BS-Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （上海圣科儀器設(shè)備有限公司）， YS-10 高速粉碎機(jī) （北京燕山正德機(jī)械設(shè)備有限公司）， FA1104 電子天平 （上海良平儀器儀表有限公司）， HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋 （金壇市富華儀器有限公司）， UV762 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) （上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 茅蒼術(shù)多糖的提取 取茅蒼術(shù)根莖清洗去雜、 切片，60 ℃烘干至恒定質(zhì)量， 按料液比1 ∶5 （m/V） 加入 95%乙醇， 65 ℃回流提取 3 次， 每次 1 h， 過(guò)濾。 將去脂的茅蒼術(shù)片晾干、 粉碎、 過(guò) 60 目篩。 準(zhǔn)確稱(chēng)取 1.000 g茅蒼術(shù)干粉，用蒸餾水提取，過(guò)濾，濾液加水定容。分別測(cè)定總糖、單糖的量，計(jì)算茅蒼術(shù)多糖含有量及提取率。

2.2 茅蒼術(shù)多糖的測(cè)定及提取率計(jì)算

2.2.1 總糖測(cè)定［8］采用苯酚-硫酸法。 （1） 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制： 準(zhǔn)確稱(chēng)取 105 ℃干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品10 mg， 將其定容于100mL量瓶中， 得到100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。 分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、 0.3、 0.6、 0.9、 1.2、 1.5 mL于試管中， 加水至總體積 2.0 mL， 加入 5%苯酚 1 mL， 混勻后迅速加入濃硫酸 5 mL， 搖勻， 室溫放置 20 min 冷卻后于 490 nm測(cè)吸光度。 橫坐標(biāo)為多糖毫克數(shù)， 縱坐標(biāo)為吸光度， 得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。 （2） 樣品測(cè)定： 吸取樣液 1.0 mL（相當(dāng)于40 μg左右的多糖）， 按上述步驟操作， 測(cè)定吸光度， 以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算總糖含有量。

2.2.2 還原糖測(cè)定［8］采用 DNS 法。 精確吸取樣品液 1 m L（含糖 50 ～100 μg左右）， 1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL， 分別置于25mL量瓶中， 各加1.5mLDNS 試劑， 搖勻置沸水浴中加熱 5 min， 迅速用涼水冷卻。 分別加水至刻度， 搖勻。 以水1mL按同樣方法操作所得溶液作空白， 在520 nm分別測(cè)定吸光度值。

2.2.3 多糖量的計(jì)算 多糖量 （%） = （總糖量 -還原糖量） ×100%。

2.2.4 多糖提取率的計(jì)算 多糖提取率 （%） = （多糖量 ×提取液體積/茅蒼術(shù)總質(zhì)量） ×100%。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過(guò)文獻(xiàn) ［9-11］ 和預(yù)試驗(yàn)， 得出影響茅蒼術(shù)多糖提取的主要因素有：纖維素酶加量、酶解溫度、酶解時(shí)間、液料比。根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)了4因素3水平， 其因素水平的編碼見(jiàn)表 1。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼

3 結(jié)果與分析

3.2 響應(yīng)曲面分析與提取工藝優(yōu)化 響應(yīng)值 Y對(duì)應(yīng)自變量X作出響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)，考察擬合響應(yīng)面的形狀，反映出它們?cè)谔崛∵^(guò)程中的相互作用及對(duì)茅蒼術(shù)多糖提取率的影響。 圖 1 為在酶解時(shí)間 90min 和液料比 20mL/g條件下，酶加量與酶解溫度對(duì)提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖。圖 2 為在酶加量 0.3%與酶解時(shí)間 90 min 條件下， 酶解溫度與液料比對(duì)提取率影響的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖。利用二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，可以得出最佳工藝條件為：纖維素酶酶加量 0.32%、 酶解溫度 52.51 ℃、 酶解時(shí)間92.21 min、液料比 22.73 mL/g， 可獲得茅蒼術(shù)多糖提取率的預(yù)測(cè)值為 36.14%。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

圖1 酶加量和酶解溫度對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖

圖2 酶解溫度和液料比對(duì)多糖提取率影響的響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖

3.3 模型驗(yàn)證 考慮到實(shí)際情況， 將上述提取工藝參數(shù)修正為： 纖維素酶酶加量 0.32%、 酶解溫度 53 ℃、 酶解時(shí)間 92 m in、 液料比 23 ∶1。 為了驗(yàn)證模型的可靠性， 在此條件下做 3 次平行試驗(yàn)， 茅蒼術(shù)多糖提取率為 （35.78 ± 0.25）%， 結(jié)果表明實(shí)際測(cè)量值與預(yù)測(cè)值較接近， 說(shuō)明該模型是合理有效。

4 討論

中藥材中植物藥占 90%， 植物藥的有效成分大多包裹在細(xì)胞壁中，而植物的細(xì)胞壁是由纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)、木質(zhì)素等物質(zhì)構(gòu)成的致密結(jié)構(gòu)。在提取藥用植物有效成分過(guò)程中，有效成分向提取介質(zhì)擴(kuò)散時(shí)，必須克服細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)的雙重阻力。選用適當(dāng)?shù)拿缸饔糜谒幱弥参锊牧?，可以通過(guò)酶反應(yīng)溫和地分解細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)中的纖維素、半纖維素、果膠質(zhì)等成分，破壞細(xì)胞壁的致密構(gòu)造，引起細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生局部疏松、膨脹、崩潰等變化，減小細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)等傳質(zhì)屏障對(duì)有效成分從胞內(nèi)向提取介質(zhì)擴(kuò)散的傳質(zhì)阻力，從而有利于有效成分的溶出［12-14］。 茅蒼術(shù) 根莖細(xì) 胞壁富含纖 維素， 利用纖維素酶處理，可改變細(xì)胞壁的通透性，有利于壁內(nèi)的多糖成分溶出，大大的提高了多糖成分的提取率。

酶法用于中藥提取，可利用相關(guān)的酶制劑代替有機(jī)溶劑提高提取物的極性，縮短提取時(shí)間，保持有效成分藥效能提高有效成分的提取率，且操作簡(jiǎn)便，對(duì)設(shè)備要求不高，條件溫和［15］。 因此， 酶法提取是一項(xiàng)很有前途的新技術(shù)，具有較大的應(yīng)用潛力。

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R284.2

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： 1001-1528（2014）05-1088-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.049

2013-03-10

凡軍民 （1977—） ， 女， 博士， 副教授， 從事生物制藥的教學(xué)和研究工作。 Tel： 13305298969， Email： junminfan77@163.com