張海勝， 喬 華， 常 威， 張曉云， 邵婷璣， 薛 虎， 趙云峰

（1.渭源縣蓮峰中心衛(wèi)生院， 甘肅 定西 748208； 2.蘭州大學第一醫(yī)院藥物臨床試驗機構， 甘肅 蘭州730000；3.蘭州大學藥學院， 甘肅 蘭州 730000）

當歸腹痛寧滴丸中藁本內酯的測定及大鼠體內的藥動學

張海勝1， 喬 華2， 常 威2， 張曉云3， 邵婷璣3， 薛 虎3， 趙云峰3

（1.渭源縣蓮峰中心衛(wèi)生院， 甘肅 定西 748208； 2.蘭州大學第一醫(yī)院藥物臨床試驗機構， 甘肅 蘭州730000；3.蘭州大學藥學院， 甘肅 蘭州 730000）

目的 了解市售當歸腹痛寧滴丸中藁本內酯的量及口服后藁本內酯在大鼠體內的藥動學。方法 用氣相色譜法測定當歸腹痛寧滴丸中藁本內酯的量， SD大鼠灌胃給藥， 在設定的時間點采血0.3 mL， 離心分離血漿， HPLC法測定藁本內酯的血藥濃度，計算藥動學參數(shù)，與藁本內酯靜脈注射給藥比較，對其在大鼠體內的藥動學特征進行評價。結果 當歸腹痛寧滴丸中藁本內酯的量為 0.19mg/粒。 當歸腹痛寧滴丸灌胃給藥后， 藁本內酯 25mg/kg組， 其 Cmax為 （620.395 ±47.69） μg/L， Tmax0.08 h， AUC（0-∞）（709.346 ±77.775） μg/L·h，t1/2z（4.331 ±1.278） h； 12.5 mg/kg組 Cmax為（173.902 ±13.654） μg/L， Tmax0.08 h， AUC（0-∞）（365.003 ±72.813） μg/L·h，t1/2z（2.236 ±0.188） h； 靜脈注射藁本內酯 25mg/kg后 Cmax（ 675.965 ±41.968 ） μg/L， Tmax0.08 h， AUC（0-∞）（ 949.501 ±63.182） μg/L·h，t1/2z（ 3.085 ± 0.137） h； 靜脈注射 12.5mg/kg時 Cmax（391.402 ±25.251） μg/L， Tmax0.08 h， AUC（0-∞）（391.078 ±26.609） μg/L·h，t1/2z（2.985 ±0.241） h。 結論 當歸腹痛寧滴丸口服， 其有效成分藁本內酯胃腸道吸收迅速， 生物利用度高， 給藥后藥時曲線呈雙吸收峰，可能與滴丸中藁本內酯釋放特征有關。

當歸腹痛寧滴丸；藁本內酯；藥動學

當歸腹痛寧滴丸是以當歸揮發(fā)油為主要原料制成的滴丸劑，具有解痙止痛的功效。主要用于婦女痛經，產后宮縮痛，感染性腹瀉引起的急性腹痛，小兒秋季腹瀉等的治療。 藁本內酯為其主要有效成分之一［1-2］。 研究表明： 藁本內酯有很強的解痙、平喘、鎮(zhèn)定作用，臨床上可用于治療支氣管炎和婦科疾?。?-5］。 研 究 顯 示［6］， 藁 本 內 酯 具 有 良好的改善微循環(huán)作用，可用于防治與微循環(huán)障礙有關的疾病， 對大鼠腦缺血有顯著保護作用［7］。 藁本內酯對癌細胞L1210， K562 具有很強抑制作用， 其 IC50分別為 （2.27 ± 0.10）、 （ 4.78 ±0.18） μmol/L， 可用于 腫 瘤 的輔助治療［8］。 此 外， 藁 本 內 酯 還 可 以 抑 制 平 滑 肌 增 殖［9］、 抑菌［10-11］、 松弛 平 滑 肌， 可 用 于 治 療 眼 睛 疲 勞 以 及 皮 膚 抗皺［12］。 基于以上藥理學基礎， 為了了解市售當歸婦痛寧滴丸中藁本內酯的量，并了解其口服給藥后的藥動學特征，本實驗以大鼠為研究對象，進行當歸腹痛寧滴丸口服給藥后藁本內酯的藥動學研究。

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑 當歸腹痛寧滴丸 （蘭州和盛堂制藥有限公司， 國藥準字 Z62020027）； 藁本內酯對照品 （川芎揮發(fā)油經分離純化， 純度 97.26%）； 鬼臼毒素 （北京醫(yī)科大學應用藥物研究所）； 氯苯那敏 （河南九勢制藥股份有限公司）； 甲醇， 乙腈 （色譜純， 山東禹王實業(yè)有限公司）； 二氯甲烷 （色譜純， 天津市凱信化學有限公司）， 石油醚（分析純， 利安隆博華醫(yī)藥化學有限公司）； 乙酸乙酯 （分析純， 利安隆博華醫(yī)藥化學有限公司）； 肝素鈉 （上海中秦化學試劑有限公司），純水自制。

1.2 實驗動物 SD大鼠， 雌雄各半， 體質量 180 ～220 g，購自 蘭 州 大 學 動 物 中 心， 合 格 證 號： SCXK （ 甘 ）2009-0004。

1.3 實驗儀 器 Agilent 7890A氣 相 色 譜 儀 （ 氫 火 焰 檢 測器， 16 位自動 進 樣器， 美國） ； Agilent1200 高效 液 相 色 譜系統(tǒng) （G1311A四元泵， G1329A自動進樣器， G1321A熒光檢測器， G1316A柱溫箱， 德國）； DT224-S 電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）； H2050R臺式高速冷凍離心機 （ 長沙湘儀離心機有限公司）； HGC-24A氮吹儀（天津恒奧有限責任公司）。

2 實驗方法

2.1 當歸腹痛寧滴丸中藁本內酯的測定

2.1.1 溶液配制

2.1.1.1 內標溶液的配制 精密稱取 5.0 mg撲爾敏于5 mL量瓶中， 甲醇溶解并稀釋至刻度， 得 1.0 mg/mL的撲爾敏溶液。 精密吸取 2 mL， 置 10 mL量瓶中， 甲醇稀釋至刻度， 得 0.2 mg/mL的撲爾敏內標溶液。

2.1.1.2 藁本內酯標準系列溶液的配制及處理 精密稱取藁本內酯對照品 （含藁本內酯 97.26%） 適量， 甲醇溶解并稀釋得 0.8、 0.6、 0.4、 0.3、 0.2、 0.1、 0.04、 0.02 mg/mL的藁本內酯標準系列溶液， -40 ℃儲存?zhèn)溆谩?分別吸取上述系列標 準 溶 液 100 μL于 1.5 mL的 離 心 管 中， 各加0.2 mg/mL撲爾敏溶液100 μL， 渦旋30 s， 10 800 r/min 離心5 min， 進樣。

2.1.1.3 當歸腹痛寧滴丸溶液的配制及處理 取當歸腹痛寧滴丸10 粒， 精密稱重， 每粒滴丸的平均質量為0.056 1 g。精密稱取 0.112 3 g（相當于兩粒滴丸） 于 10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度， 得到 11.2 mg/mL的滴丸溶液。取該溶液 100 μL于 1.5mL離心管， 加0.2mg/mL的撲爾敏內標溶液 100 μL， 混 勻， 離 心 （10 800 r/min） 5 min 后進樣。

2.1.2 氣相色譜分離條件及方法特異性 Agilent7890A氣相色譜儀， 采用 HP-5 石英毛細管色譜柱 （30 m×320 μm ×0.25 μm）， 以氮氣為載氣， 載氣體積流量 4 mL/min， 分流比 30 ∶1， 柱溫采用程序升溫， 升溫程序為 100 ℃保持2 min后， 以 5 ℃ /min 的速度升高至 240 ℃， 并保持 2min。進樣量為 1 μL， 采集時間為 13.33 m in。 取 “2.1.1.2” 項及 “2.1.1.3” 項 溶液 進 樣 分 析， 得 藁 本 內 酯 （8.198 m in） 、 撲爾敏 （10.175 min） 氣相色譜圖。 見圖 1 ～3。

圖1 空白氣相色譜圖

圖 2 藁本內酯 （8.198m in） ， 撲爾敏 （10.175m in） 氣相色譜圖

圖3 當歸腹痛寧滴丸及內標撲爾敏氣相色譜圖

2.1.3 標準曲線的制備及線性 取 “2.1.1.2” 項配制的系列溶液， 按 “2.1.2” 項色譜條件進樣分析， 以藁本內酯與撲爾敏色譜峰面積比對溶液質量濃度線性回歸，得藁本內酯標 準 曲 線 方 程 C=0.093 9SGBNZ/IS+0.011 4 （ r2= 0.997 8）， 線性范圍 0.02 ～0.8 mg/mL。

2.1.4 當歸腹痛寧滴丸中藁本內酯的測定 取 “2.1.1.3”項下配制的樣品溶液， 按 “2.1.2” 項色譜條件進樣分析，平行測試兩次， 將面積比代入 “2.1.3” 項標準曲線方程，計算藁本內酯的量，并根據(jù)稀釋倍數(shù)計算得每粒滴丸中藁本內酯的量為 0.19 mg藁本內酯 （0.34%）。

2.2 當歸腹痛寧滴丸中藁本內酯的藥動學

2.2.1 標準溶 液的制 備 精密稱取藁 本 內酯對照品10.0 mg（含藁本內酯 97.26%， 實稱 10.2 mg）， 置 10 mL量瓶中， 加乙腈并稀釋， 定容至刻度， 得 1 mg/mL藁本內酯貯備液， -40 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?臨用時以乙腈稀釋配制成質量濃度為 0.009 7、 0.019 5、 0.039、 0.078、 0.156、0.313、 0.625、 1.25、 2.5、 4.0、 5.0、 10、 20、 40 μg/mL的藁本內酯標準系列溶液。

精密稱取鬼臼毒素5.0mg， 置5mL量瓶中， 乙腈溶解并定容， 制成 1 mg/mL的鬼臼毒素溶液。 臨用前， 加乙腈稀釋成 10 μg/mL的鬼臼毒素內標溶液。

精密稱取藁本內酯 25.4 mg， 置 5 m L量瓶中， 加注射用磷脂 25 mg， 無水乙醇 200 μL， 渦旋混勻， 用生理鹽水稀釋至刻度， 搖勻制得 5 mg/mL藁本內酯乳劑， 供大鼠口服及靜脈注射。

精密稱取當歸腹痛寧滴丸粉末 1.46 g（相當于滴丸26 粒）， 加生理鹽水混合均勻， 轉移至 5 mL量瓶中， 渦旋混勻得 0.5 g/mL的滴丸混懸液 （供低劑量組大鼠灌胃給藥）。 另取2.19 g的滴丸粉末， 同法配制0.73 g/mL的滴丸混懸液 （供高劑量組大鼠灌胃給藥）。

2.2.2 藁本內酯血藥濃度測定的色譜條件 采用 YMC-pack ODS-A （150mm×4.6mm， 5 μL） 色譜柱， 流動相乙腈-水 （1 ∶1）， 體積流量為 1.0mL/min， 柱溫 50 ℃， 用熒光檢測器。 0 ～4 min， Ex為 290 nm， Em為 395 nm， 在4 ～14 min， Ex為 336 nm， Em為 453 nm。 進樣量 50 μL。

2.2.3 方法專屬性 取大鼠空白血漿 100 μL， 置 1.5 mL離心管中，加鬼臼毒素內標溶液及藁本內酯標準溶液各25 μL， 渦旋混勻， 加二氯甲烷 1 mL， NaCl少許， 渦旋提取 5min， 10 800 r/min 離心 5min， 取二氯甲烷層， 氮氣吹干， 殘渣用 100 μL流動相溶解， 按 “2.2.2” 項色譜條件進樣 50 μL。 得藁本內酯及內標加空白血漿的色譜圖， 見圖 4。 鬼臼毒素的保留時間約為 3.3 min， 藁本內酯的保留時間約為 12.4 min， 同法處理用藥后采集的血漿樣品， 進樣分析，從中可以看出，藁本內酯及內標和內源性雜質之間無干擾。

圖4 高效液相色譜圖

2.2.4 標準曲線的制備及線性 取 “2.2.1” 項配制的標準系列溶液， 按 “2.2.3” 項方法處理并進樣測定， 以藁本內酯的血藥濃度為橫坐標，藁本內酯與鬼臼毒素的色譜峰面積比為縱坐標進行線性回歸計算，得兩條標準曲線方程：Y= 133.49X-14.27 （r=0.999 5， 線性范圍為 2.44 ～156 ng/mL），Y=145.61X+13.76 （r=0.999 6， 線性范圍為 0.156 ～10 μg/mL， 藁本內酯血藥濃度與色譜峰面積比在各自的范圍之內線性關系良好。

2.2.5 精密度和回收率試驗 按 “2.2.3” 項方法配制質量濃度為 4.88、 39、 156、 1 250、 5 000 ng/mL的藁本內酯大鼠血漿樣品并按該方法處理，進樣分析，一日內連續(xù)進樣5 次， 連續(xù)測定 3 日， 計算日內及日間 RSD。 結果見表1。將藁本內酯與鬼臼毒素峰面積比代入標準曲線方程， 計算藁本內酯血藥濃度，與配制濃度比較計算方法回收率（表1）。 結果顯示該方法的精密度和準確度符合定量測定的要求。

表 1 測定方法的精密度和回收率 （n=5）

2.2.6 動物實驗 取 SD大鼠 24 只， 體質量 180 ～220 g之間， 雌雄各半， 購買后適應性飼養(yǎng) 48 h， 實驗前禁食 12 h，期間自行飲水。 將 SD大鼠隨機分為4組， 每組 6只， 分別為藁本內酯靜脈注射組 （25、 12.5 mg/kg）， 當歸腹痛寧滴丸 25 mg/kg劑量組及 12.5 mg/kg劑量組。 取 “2.2.1” 項下配制的藁本內酯乳劑，靜脈注射組依大鼠體重尾靜脈注射給予適當?shù)乃幜?。當歸腹痛寧滴丸組則灌胃給予適當體積的滴丸混 懸液， 并于靜 脈 注 射及灌胃后 5 min、 15 min、30 min、 45 min、 1 h、 2 h、 3 h、 5 h、 8 h、 12 h、 24 h 眼眶采血 0.3mL， 肝素抗凝， 離心分離血漿， -40 ℃低溫保存?zhèn)錅y。

2.2.7 血藥濃度的測定及藥時曲線 取 “2.2.5” 項采集的血漿 100 μL， 加 內標 25 μL， 乙腈 25 μL， 混勻， 按“2.2.3” 項方法處理， “2.2.2” 項色譜條件進樣分析， 測定血藥濃度， 繪制藥時曲線，見圖5。

2.2.8 主要藥動學參數(shù) 對上述血藥濃度時間數(shù)據(jù)， 經DAS2.1 統(tǒng)計分析， 得主要藥動學參數(shù)， 見表 2。

3 討論

3.1 藁本內酯具有苯肽結構， 很不穩(wěn)定， 易發(fā)生脫氫、 氧化、 水解等多種異構化或降解反應［13］， 藥品在儲存過程中成分含有量逐漸降低，影響藥效，因此，實驗對當歸腹痛寧滴丸中藁本內酯的量進行了考察。

表2 主要藥動學參數(shù)

圖5 血藥濃度 -時間曲線圖

3.2 在藁本內酯血藥濃度分析的過程中， 為了提高測試的靈敏度，本實驗針對藁本內酯具有脂溶性，熒光較強的特點，采用二氯甲烷提取，熒光檢測器檢測的方法進行血藥濃度分析， 僅用 0.1mL血漿， 定量下限達 2.44 ng/mL。

3.3 從藥時曲線可以看出， 藁本內酯靜注后在體內的分布符合二室模型，其血藥濃度迅速達到峰值并快速向周圍組織分布形成分布項，其消除項血藥濃度降低相對較慢。當歸腹痛寧滴丸灌胃給藥后，其吸收也很迅速，并很快達到峰值，這可能與藁本內酯具有較高的脂溶性，其中速釋部分釋放后迅速吸收有關。同靜脈注射相比，滴丸口服給藥后存在雙吸收峰，這可能與滴丸中部分藁本內酯后續(xù)緩慢釋放有關。經計算，當歸腹痛寧滴丸口服后在大鼠體內的生物利用度約為 74.7% ～93.3%。

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R969.1

： B

： 1001-1528（2014）05-1068-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.043

2013-03-15

張海勝 （1978—） ， 男， 主管藥師， 主要從事中藥研究及調劑。 E-mail： qhbrian@163.com