楊 政， 蔣琳蘭*

（1.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科， 廣東 廣州 510010； 2.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 廣東 廣州510006）

茶多酚和銀杏葉提取物聯(lián)用體外抑制 ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡

楊 政1，2， 蔣琳蘭1，2*

（1.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科， 廣東 廣州 510010； 2.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院， 廣東 廣州510006）

目的 探討茶多酚和銀杏葉提取物聯(lián)用對(duì)氧化型低密度脂蛋白 （ox-LDL） 誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 （HUVEC）凋亡的體外抑制作用， 比較單個(gè)成分與兩者聯(lián)用組成復(fù)方的抑制效果。 方法 CCK-8 法檢測(cè)藥物對(duì) HUVEC的細(xì)胞毒性，選擇藥物作用質(zhì)量濃度；分別給予不同質(zhì)量濃度茶多酚和銀杏葉提取物聯(lián)用組、茶多酚組和銀杏葉提取物組處理HUVEC后， ox-LDL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡， 吖啶橙熒光染色觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化， Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HUVEC的凋亡率。 結(jié)果 低質(zhì)量濃度 （20 μg/mL） 茶多酚與銀杏葉提取物聯(lián)合使用組的細(xì)胞毒性明顯低于單獨(dú)用藥組， 二者聯(lián)用對(duì) ox-LDL破壞細(xì)胞形態(tài)有保護(hù)作用， 抑制 ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。 結(jié)論 茶多酚和銀杏葉提取物聯(lián)用可抑制 ox-LDL誘導(dǎo)的 HUVEC凋亡； 茶多酚和銀杏葉提取物聯(lián)用的抑制效果好于銀杏葉提取物或茶多酚單用。

茶多酚；銀杏葉提取物；氧化型低密度脂蛋白；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

茶多酚 （ Tea Polyphenols， TP） 是茶 葉 中 多羥 基 酚 類化合物的總稱，是茶葉中的主要藥用活性成分，約占干茶比例的 30%， 包括兒茶素類和黃酮類等多種成分。 TP主要成分由兒茶素類物質(zhì)構(gòu)成，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其中以單體表 沒(méi) 食 子兒 茶 素 沒(méi) 食 子 酸 酯 （ Epigallocateehin gallate， EGCG） 抗氧化活性最強(qiáng)， 應(yīng)用范圍最廣［1-2］。 銀杏葉提取物 （Ginkgo Biloba Extract， GBE） 是從銀杏葉中提取的具有藥用活性的化合物， GBE有兩大主要活性成分： 總黃酮類和萜內(nèi)酯類化合物，其中總黃酮類包括異鼠李素、山柰酚、槲皮素等二十多種成分；萜內(nèi)酯類化合物主要包括銀杏內(nèi)酯 A、 B、 C和白果內(nèi)酯［3］， 他們具有的獨(dú)特植物萜烯結(jié)構(gòu)， 在治療心腦血管疾病中被廣泛應(yīng)用［4］。 低密度脂蛋白 （ low density lipoprotein， LDL） 可被氧 化 修 飾 成 氧 化型低密度脂蛋白 （oxidized low density lipoprotein， ox-LDL），ox-LDL可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)相關(guān)炎癥因子， 進(jìn)一步促使泡沫細(xì)胞的形成，在動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展中發(fā)揮重要作用［5-6］。 多項(xiàng)研 究表明， ox-LDL可以通過(guò) 誘 導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡， 進(jìn)而顯示其細(xì)胞毒性［7］。 本實(shí)驗(yàn)從凋亡角度觀察 TP和 GBE聯(lián)用對(duì) ox-LDL細(xì)胞毒性的體外抑制作用。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于茶多酚和銀杏葉提取物單獨(dú)作用抗凋亡的研究已見(jiàn)報(bào)道，但尚無(wú)關(guān)于茶多酚聯(lián)用銀杏葉提取物抗凋亡作用研究的報(bào)道，本研究旨在探討二者聯(lián)用體外抑制 ox-LDL誘 導(dǎo) 的 人 臍 靜 脈 內(nèi) 皮 細(xì) 胞 （ humanumbilical vein endothelial cells， HUVEC） 凋 亡， 為 心 血 管 疾 病 的 聯(lián) 合 用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品及試劑 茶多酚 （純度 ＞95%， 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯 ＞40%） 由廣東惠州綠源保健品有限公司提供； 銀杏葉提取物 （銀杏黃酮≥24%， 內(nèi)酯≥6%） 由廣東惠州綠源保健品有限公司提供； ox-LDL購(gòu)于廣州奕源生物科技有限公司； CCK-8 購(gòu)于日本同仁化學(xué)研究所；DMEM （高糖） 培養(yǎng)基、 胎牛血清、 雙抗 （青霉素及鏈霉素溶液）、 胰蛋白酶 （0.25%EDTA） 購(gòu)于美國(guó) Hyclone公司； 吖啶橙購(gòu)于 MBCHEM 公司； Annexin V-FITC/PI試劑盒購(gòu)于美國(guó) BioVision 公司。

1.2 主要儀器設(shè)備 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 箱 （ Forma Scientific Inc），超凈工作臺(tái) （蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）； 5410 型恒溫CO2培養(yǎng)箱 （美國(guó) NAPCO公司）； IX70 倒置顯微鏡 （ 日本OLYMPUS 公司）； 酶標(biāo)儀 （美國(guó) BIOCELL公司）； 倒置熒光顯微鏡 （ 日本 OLYMPUS 公司） ； 流式細(xì)胞儀 （ 美國(guó) Millipore公司）。

1.3 細(xì)胞系 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株 （HUVEC）， 由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)科提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞懸液的制備 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC培養(yǎng)于含 10%胎牛血清、 終濃度為 100 U/mL的青霉素和鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)液中， 置 37 ℃、 5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 HUVEC細(xì)胞，接種于96 孔板， 各孔體積 100 μL， 含有 1 ×104個(gè)細(xì)胞， 分別加入不同終質(zhì)量濃度 （20、 40、 80、 160、 320 μg/mL） 的茶多酚和不同終質(zhì)量濃度 （20、 40、 80、 160、 320 μg/mL）的銀杏葉提取物培養(yǎng)24 h， 同時(shí)設(shè)定不加藥的正常對(duì)照組和無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基空培的空白對(duì)照組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。預(yù)處理結(jié)束， 加 ox-LDL至終質(zhì)量濃度為 100 μg/mL培養(yǎng) 24 h， 到達(dá)時(shí)點(diǎn)后， 加入 CCK-8 10 μL/孔， 繼續(xù)培養(yǎng) 1 h， 于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度 A值。 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率計(jì)算公式：細(xì)胞增殖率 = （實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照組A值） /（正常對(duì)照組 A值 -空白對(duì)照組 A值） ×100%。

1.4.3 吖啶橙 （AO） 熒光染色 細(xì)胞以每孔 1 ×105個(gè)/mL接種于6孔板中，每孔各放入一爬片專用蓋玻片，細(xì)胞貼壁后加入藥物作用 24 h， 接著加 ox-LDL處理 24 h。 取出細(xì)胞爬片， PBS 漂洗 3 次， 以 95%乙醇固定 5min， 待乙醇微干，用 0.01%AO染液染色 5 min， PBS 臨時(shí)固封， 熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng) 24 h 后， 實(shí)驗(yàn)組分別加茶多酚 （終質(zhì)量濃度為 20 μg/mL）、 銀杏葉提取物 （終質(zhì)量濃度為 20 μg/mL）、 兩藥混合 （1 ∶1， 終質(zhì)量濃度為20 μg/mL）， 模型組、 正常對(duì)照組不加藥處理 24 h 后， 除正常 對(duì) 照 組 外 其 他 各 組 均 加 ox-LDL至 終 質(zhì) 量 濃 度 為100 μg/mL， 37 ℃、 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h， 胰酶消化制成單細(xì)胞懸液， 1 000 r/min 離心 5min， 棄上清， 用預(yù)冷的 PBS 漂洗細(xì)胞 2 次， 調(diào)整細(xì)胞密度為 1 ×105個(gè)/mL， 用190 μL預(yù)冷的 1 ×Binding Buffer輕輕重懸， 加 5 μLAnnexin V-FITC室溫避光反應(yīng) 10 m in， 接著加 5 μL PI室溫避光反應(yīng)， 隨即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)， 激發(fā)波長(zhǎng) 488 nm測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8 法 檢 測(cè) 細(xì) 胞 增 殖 活 性 茶 多 酚 20、 40、 80、160、 320 μg/mL 作 用 HUVEC 時(shí)， 以 正 常 對(duì) 照 組（0 μg/mL） 為準(zhǔn)， 重復(fù)次數(shù) （n=6）， 細(xì)胞的增殖率分別為92.08%、 89.65%、 86.84%、 84.39%和 33.25%， 其中 80、160、 320 μg/mL 3 組細(xì)胞增殖率與空白對(duì)照組差異極顯著（P＜0.01） （表 1）。 同樣計(jì)量的銀杏葉提取物作用細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的增殖率分別為 94.06%、 89.16%、 85.09%、 83.30%和 81.57%， 其中 80 μg/mL組細(xì)胞 增 殖率與正 常 對(duì) 照組（0 μg/mL） 差異顯著 （P＜0.05）， 160 μg/mL、 320 μg/mL組與正常對(duì)照組差異極顯著 （P＜0.01） （表 1）。 兩種藥物在劑量為 20 μg/mL和 40 μg/mL時(shí)， 細(xì)胞增殖率與正常對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，且兩種劑量間也無(wú)顯著差異，小劑量20 μg/mL組的細(xì)胞增殖率高于 40 μg/mL組。 因此， 為檢測(cè)兩種藥物聯(lián)用時(shí)的保護(hù)作用，銀杏葉提取物和茶多酚都選擇小劑量 20 μg/mL用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)； 聯(lián)用組 20 μg/mL， 銀杏葉提取物和茶多酚比例1 ∶1。

2.2 吖啶橙 （AO） 熒光染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征

熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示 （如圖 1）， 正常對(duì)照組 （E） 細(xì)胞形態(tài)正常，增殖旺盛，鏡下可見(jiàn)呈正常生長(zhǎng)分裂狀態(tài)的細(xì)胞； ox-LDL 100 μg/m L單獨(dú)處理細(xì)胞 24 h 后 （D）， 細(xì)胞密度減少，并可見(jiàn)典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)特征：核固縮、體積縮小和表面起泡，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)致密濃染的黃綠色熒光；茶多酚聯(lián)合銀杏葉提取物預(yù)處理細(xì)胞后（C）， 細(xì)胞增殖旺盛， 細(xì)胞質(zhì)和核仁內(nèi)有大量 RNA， 被染為桔黃或桔紅色熒光， 細(xì)胞核中有大量 DNA， 表現(xiàn)為黃綠色熒光深淺不一的結(jié)構(gòu)樣特征； 茶多酚組 （A）、 銀杏葉提取物組 （B） 細(xì)胞形態(tài)良好， 但鏡下仍有細(xì)胞體積縮小，銀杏葉提取物鏡下有細(xì)胞核固縮，呈現(xiàn)凋亡晚期狀態(tài)。

表 1 HUVEC細(xì)胞增殖活性檢測(cè) （n=6，）

表 1 HUVEC細(xì)胞增殖活性檢測(cè) （n=6，）

注： 與正常對(duì)照組 （0 μg/m L） 比較，*P＜0.05，**P＜0.01

茶多酚/（μg·mL-1）細(xì)胞增殖率/ %銀杏葉提取物/（ μg·m L-1）細(xì)胞增殖率/ % 0 100.000 0 0 100.000 0 20 92.075 9 ±6.419 1 20 94.060 1 ±11.816 4 40 89.653 1 ±9.585 1 40 89.164 0 ±7.371 0 80 86.843 0 ±4.714 4** 80 85.088 9 ±7.088 0*160 84.393 0 ±4.076 2** 160 83.301 3 ±4.584 0**320 33.249 0 ±2.592 4** 320 81.569 6 ±5.884 3**

圖1 吖啶橙法觀察細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)

2.3 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 結(jié)果顯示（如圖2）： 圖形經(jīng)十字分成四個(gè)區(qū)域， 左下角區(qū)域?yàn)檎ＩL(zhǎng)的活細(xì)胞；右下角區(qū)域?yàn)樵缙诘蛲龅募?xì)胞；右上角區(qū)域?yàn)榈蛲鐾砥诘募?xì)胞和壞死細(xì)胞；左上角區(qū)域?yàn)榧?xì)胞收集過(guò)程中被損傷少量細(xì)胞和細(xì)胞碎片。 不同實(shí)驗(yàn)組抑制 ox-LDL誘導(dǎo) HUVEC凋亡作用見(jiàn)表2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

表 2 不同實(shí) 驗(yàn) 組 抑 制 ox-LDL誘導(dǎo) HUVEC凋亡 的 作 用（n=6，）

表 2 不同實(shí) 驗(yàn) 組 抑 制 ox-LDL誘導(dǎo) HUVEC凋亡 的 作 用（n=6，）

注： 與模型組比較，*P＜0.05

組別 凋亡率/%茶多 酚 20 μg/m L組20.44 ±1.32銀杏 葉提 取物 20 μg/m L組 21.28 ±0.86茶多 酚聯(lián) 合銀杏葉提 取物 20 μg/m L組 15.30 ±1.09*模型組 22.84 ±1.18正常對(duì)照組13.93 ±0.78

3 討論

內(nèi)皮功能 紊 亂 是 動(dòng) 脈 粥 樣 硬 化 （ Atherosclerosis， AS ）早期表現(xiàn)的主要特征之一［8］。 ox-LDL可以損傷內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成， ox-LDL還能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡， 促進(jìn) AS 形成及發(fā)展［9］。 近年來(lái) ox-LDL通過(guò)作用內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)而影響 AS 的發(fā)生發(fā)展方面的研究越來(lái)越受到重視，為尋求更多的治療方法，中藥在預(yù)防治療心血管疾病中的作用越來(lái)越明顯［10］。 基于此， 本實(shí)驗(yàn)探討了銀杏葉提取物和茶多酚聯(lián)合應(yīng)用抑制 ox-LDL誘導(dǎo)的人氣靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用， 為將兩者聯(lián)合應(yīng)用于預(yù)防治療AS提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，不同質(zhì)量濃度的銀杏葉提取物和茶多酚分別作用于HUVEC， 對(duì)細(xì)胞的增殖具有抑制作用， 兩者在低質(zhì)量濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞的抑制作用較對(duì)照組不明顯，高質(zhì)量濃度茶多酚的抑制作用明顯，因此兩者均選擇低質(zhì)量濃度用以探究?jī)烧呗?lián)用對(duì) ox-LDL誘導(dǎo) HUVEC凋亡的抑制作用。 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示， 模型組凋亡率為 22.84%， 正常對(duì)照組凋亡率為13.93%， 茶多酚和銀杏葉提取物都有抑制 ox-LDL誘導(dǎo) HUVEC凋亡的作用， 兩組凋亡率分別為 20.44%和21.28%， 聯(lián)合用藥是凋亡率為 15.30%， 結(jié)果表明單獨(dú)用藥作用不明顯，聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同抑制細(xì)胞凋亡作用，較單用其中一種藥物時(shí)效果提高，且差異顯著。吖啶橙染色后可直接觀察到經(jīng) ox-LDL作用后細(xì)胞體積縮小， 胞質(zhì)濃縮， 核固縮和表面起泡等凋亡的形態(tài)學(xué)特征，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)致密濃染的黃綠色熒光，為核染色質(zhì)固縮所致。加入銀杏葉提取物和茶多酚處理，細(xì)胞形態(tài)改善，但仍有核固縮和染色質(zhì)固縮現(xiàn)象，聯(lián)用組細(xì)胞形態(tài)正常，未發(fā)現(xiàn)異常的細(xì)胞形態(tài)。 以上結(jié)果表明銀杏葉提取物和茶多酚聯(lián)用能抑制 ox-LDL誘導(dǎo)的 HUVEC凋亡， 抑制效果要好于單獨(dú)用藥。 盡管兩者聯(lián)合應(yīng)用呈現(xiàn)協(xié)同增強(qiáng)效果，但在哪些環(huán)節(jié)上產(chǎn)生協(xié)同作用尚不清楚，其分子機(jī)制尚需深入研究。

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R285.5

： B

： 1001-1528（2014）05-1062-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.041

2013-06-12

廣東省重大科技專項(xiàng) （2011A0803000）

楊 政 （1989—） ， 男， 碩士生， 研究方向： 藥物天然產(chǎn)物。 Tel： 13763339781； E-mail： jasonright@163.com

*通信作者： 蔣琳蘭 （1962—） ， 女， 碩士， 主任藥師， 研究方向： 天然藥物及醫(yī)院制劑。 E-mail： jlinlan@163.net