李德斌， 黃志芳， 劉云華， 劉玉紅， 陳 燕， 易進(jìn)海*

（1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137）

黃藥子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

李德斌1，2， 黃志芳1， 劉云華1， 劉玉紅1， 陳 燕1， 易進(jìn)海1*

（1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137）

目的 建立黃藥子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用薄層色譜法對(duì)黃藥子中黃獨(dú)素B進(jìn)行定性研究；采用高效液相色譜方法定量檢測黃獨(dú)素 B， 選用 ZORBAX Eclipse XDB C18柱 （4.6mm×150 mm， 5 μm） ； 柱溫為 35 ℃； 流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液 （32 ∶68）； 體積流量 1.0mL/min； 檢測波長為 210 nm； 依據(jù) 《中國藥典》 2010 年版方法對(duì)黃藥子進(jìn)行水分、 總灰分等各項(xiàng)檢查。 結(jié)果 黃藥子藥材中水分 10.5% ～13.2%， 總灰分 2.22% ～4.02%， 酸不溶性灰分0.08% ～0.63%， 醇溶性浸出物含有量7.6% ～12.9%； 飲片中水分8.1% ～11.7%， 總灰分2.78% ～3.84%， 酸不溶性灰分 0.06% ～0.53%， 醇溶性浸出物含有量 6.9% ～12.0%； 薄層鑒別專屬性強(qiáng)； 黃藥子藥材和飲片中黃獨(dú)素 B含有量在 0.15% ～0.48%范圍內(nèi)。 黃獨(dú)素 B在進(jìn)樣量 0.155 36 ～1.553 6 μg（r=0.999 9） 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，平均回收率為 100.26% （RSD=1.47%）。 結(jié)論 本方法可靠、 準(zhǔn)確、 專屬性強(qiáng)， 可作為黃藥子的質(zhì)量控制方法。

黃藥子；黃獨(dú)素B；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜；高效液相色譜

黃藥子為薯蕷科植物黃獨(dú) Dioscorea bulbifera L.的干燥塊莖［1-3］，具 有散結(jié) 消癭、 清熱解 毒、 涼血止血之功效。用于癭瘤痰核，癥瘕痞塊，瘡瘍腫毒，咽喉腫痛，吐血，衄血，咯血，毒蛇咬傷［4-7］。黃藥子主要生物 活性物質(zhì)為其所含 的二萜內(nèi)酯類成分，主要有 diosbulbins A-H （黃獨(dú)素 AH）［8］。 研究表明， 黃獨(dú)素 B具有抗腫瘤、 抗炎的藥理活性，但也很可能是誘導(dǎo)肝毒性的主要毒性成分［9］，因此有必要對(duì)其制定限量范圍。黃藥子曾收載于 《中國藥典》 1963 年版一部、 衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥材第一冊 （1992 年版）、 江蘇省中藥材標(biāo)準(zhǔn) （1989 年版）、 四川省 中藥材 標(biāo)準(zhǔn) （1987 年版）、 廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn) （2011 年版） 等， 但上述標(biāo)準(zhǔn)尚無成分定量測定和薄層鑒別等內(nèi)容。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)藥典委下達(dá)的計(jì)劃任務(wù)， 研究建立 TLC鑒別項(xiàng)、檢查項(xiàng)、浸出物項(xiàng)和成分定量測定項(xiàng)等，進(jìn)一步規(guī)范完善提高黃藥子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200 型高效液相色譜儀 （ 美國安捷倫科技 有 限 公 司）； KQ-100 超 聲 波 清 洗 儀（昆山市超聲儀器有限公司）； AUW220D型十萬分之一電子天平 （ 日本島津）； Sigma3K15 高速冷凍離心機(jī) （德國 Sigma）； Milli-Q Integral 3 超純水機(jī)（Millipore）。

1.2 試 藥 黃 獨(dú)素 B對(duì)照品 （批號(hào)： MUST-10101311） 購自成都曼斯特生物科技有限公司。甲醇 為 美 國 Fisher色 譜 純， 水 為 超 純 水， 其 他試劑均為分析純。本實(shí)驗(yàn)收集到不同批次的黃藥子藥材 10批和飲片 6批， 經(jīng)鑒定為薯蕷科植物黃獨(dú) Dioscorea bulbifera L.的 干燥 塊 莖 的 炮 制加工品。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別 取本品粉末 0.5 g，加甲醇 5 mL，超聲處理 20 min， 濾過， 濾液作為供試品溶液。 另取黃獨(dú)素 B對(duì)照品， 加甲醇制成每 1 m L含 0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述供試品溶液10 μL和對(duì)照品溶液 5 μL， 分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，分別以三氯甲烷-甲醇 （20 ∶1） 和正丁醇-冰醋酸-水 （4 ∶1 ∶5） 的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茴香醛試液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。上述兩種展開系統(tǒng)均能得到較好的色譜分離，色譜斑點(diǎn)清晰，以前者為佳。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，試驗(yàn)表明該鑒別方法專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，準(zhǔn)確、 靈敏、 可行。 見圖1和圖2。

圖1 黃藥子藥材薄層色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of raw medicinal

圖2 黃藥子飲片薄層色譜圖Fig.2 TLC chromatogram of herbal pieces

2.2 水分測定 照 《中國藥典》 2010 年版一部附錄Ⅸ H水分測定法第一法 （ 烘干法） 測定［10］。 黃藥子藥材中水分幅度范圍為 10.5% ～13.2%， 黃藥子飲片中水分幅度范圍為 8.1% ～11.7%， 故暫定黃藥子藥材中水分不得過 15.0%， 黃藥子飲片中水分不得過 13.0%。

2.3 浸出物測定 照 《中國藥典》 2010 年版一部附錄X A浸出物測定法 （醇溶性浸出物測定法）項(xiàng)下的熱浸法測定，用乙醇作溶劑。黃藥子藥材和飲片中醇溶性浸出物的含有量幅度范圍分別為7.6%～12.9%和6.9% ～12.0%， 故暫定黃藥子藥材醇溶性浸出物的量不得少于 5.0%， 黃藥子飲片中醇溶性浸出物的量亦不得少于 5.0%。

2.4 總灰分和酸不溶性灰分 照 《中國藥典》2010 年版一部附錄Ⅸ K灰分測定法測定。 黃藥子藥材中總灰分幅度范圍為 2.22% ～4.02%， 酸不溶性灰分幅度范圍為 0.08% ～0.63%， 故暫定黃藥子藥材總灰分不得過 5.0%， 酸不溶性灰分不得過1.0%。 黃藥子飲片中總灰分幅度范圍為 2.78% ～3.84%， 酸 不 溶 性 灰 分 幅 度 范 圍 為 0.06% ～0.53%， 故暫 定 黃 藥 子 飲 片 中 總 灰 分 不 得 過5.0%， 酸不溶性灰分不得過 1.0%。

2.5 黃獨(dú)素 B測定

2.5.1 色譜 條 件 ZORBAX Eclipse XDB C18色譜 柱 （4.6 mm ×150 mm， 5 μm）； 柱 溫 為35 ℃； 流動(dòng) 相 為 甲 醇-0.1% 磷 酸 （ 32 ∶68 ） ；體積流 量1.0 m L/min； 進(jìn) 樣 量 為 5 μL； 檢測 波長為 210 nm。 對(duì)照品溶液及供試品溶液的色譜圖見圖 3、 圖 4。

圖3 黃獨(dú)素 B對(duì)照品 HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of reference of diosbu lbins B

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃獨(dú)素 B對(duì)照品適量， 加甲醇制成每1 mL含黃獨(dú)素 B 0.15 mg的溶液，即得。

圖4 黃藥子樣品 HPLC圖譜Fig.4 HPLC chromatogram of sample of Dioscorea bulbifera L.

2.5.3 供試品溶液的制備 取本品粉末 （過三號(hào)篩） 約1 g，精密稱定， 置具塞錐形瓶中， 精密加入甲醇 50 m L， 稱定質(zhì)量， 加熱回流 1 h， 放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過， 精密量取續(xù)濾液 25 mL， 蒸干， 殘?jiān)铀?0 mL溶解轉(zhuǎn)入分液漏斗中， 用三氯甲烷振搖提取3 次， 每次20 mL， 合并三氯甲烷液， 蒸干， 殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?10 mL量瓶中， 搖勻， 濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.5.4 線性關(guān)系考察 精密吸取上述對(duì)照品溶液1、 2、 4、 6、 8、 10 μL， 注入液相色譜儀中， 以進(jìn)樣量 （μg） 為橫坐標(biāo)， 對(duì)照品峰面積 （A） 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程： Y=904.47X-0.17 （r=0.999 9）。 黃 獨(dú) 素 B 在 0.155 36 ～1.553 6 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.5.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液 5 μL，注入液相色譜儀，測定黃獨(dú)素B的峰面積，重復(fù)6次， 結(jié)果黃獨(dú)素 B峰面積的 RSD為 0.44%， 表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性 試驗(yàn) 精密吸 取供試品 溶 液 5 μL， 在相應(yīng)色譜條件下于 0、 2、4、 6、12、 24 h分別進(jìn)樣，測定黃獨(dú)素B的峰面積，結(jié)果峰面積 RSD為 0.42%， 表明供試品于 24 h 內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定。

2.5.7 重復(fù)性試驗(yàn) 照 “2.5.3” 項(xiàng)供試品溶液的制備下操作， 對(duì)同一批藥材樣品 （2#） 進(jìn)行多次測定，計(jì)算，得黃獨(dú)素 B的平均含有量為0.329 5%， RSD為 0.63%， 表 明 該 方 法重 復(fù) 性良好。

2.5.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知黃獨(dú)素 B量的黃藥子藥材 （2#） 0.5 g， 精密稱定， 準(zhǔn)確加入黃獨(dú)素 B對(duì)照品溶液 （0.388 4 mg/mL） 4.2 mL， 照“2.5.3” 項(xiàng)供試品溶液的制備操作，測定，計(jì)算回收率，平均回收率為 100.26%， RSD為 1.47%。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)Tab.1 Results of recovery tests

2.5.9 樣品測定 按照上述黃獨(dú)素 B的 HPLC測定條件和方法， 對(duì) 16 批黃藥子藥材和飲片進(jìn)行了測定，再根據(jù)相應(yīng)藥材和飲片的含水量，換算成以干燥品計(jì)算含黃獨(dú)素B的量，結(jié)果見表2。 由表2可見，黃藥子藥材和飲片中黃獨(dú)素B的幅度范圍為 0.15% ～0.48%， 差異不大。 故暫定本品按干燥 品 計(jì) 算， 含 黃 獨(dú) 素 B （C19H20O6） 不 得 超 出0.15% ～0.50%范圍。

表 2 16 批不同產(chǎn)地黃藥子藥材及飲片樣品Tab.2 Sixteen batches of Dioscorea bu lbifera L.from different habitats

3 討論

3.1 薄層鑒別 黃藥子目前還沒有法定對(duì)照藥材提供， 故未采用以黃藥子對(duì)照藥材為對(duì)照進(jìn)行 TLC鑒別。 黃藥子主要代表性的毒/效成分——黃獨(dú)素B對(duì)照品可從市場上多家公司買到，故以黃獨(dú)素B對(duì)照品為對(duì)照進(jìn)行 TLC鑒別。

3.2 方法學(xué)考查 參照文獻(xiàn) ［11-12］， 以甲醇作為提取溶劑，對(duì)黃藥子常規(guī)提取方法進(jìn)行比較研究。結(jié)果甲醇加熱回流1 h和2 h提取效果相當(dāng)，均優(yōu)于超聲提取， 故選擇甲醇加熱回流1 h。 采用3 根不同商品規(guī)格的 C18色譜柱 （ ZORBAX Eclipse XDB C18、 SUPELCO Discovery C18、 Phenomenex Luna C18） 對(duì)同一批藥材 （2#）樣品進(jìn)行測定， 計(jì)算黃獨(dú)素 B含有量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差， 結(jié)果 RSD為1.21%。 對(duì)流動(dòng)相的組成與比例進(jìn)行了比較、 篩選。 經(jīng)比較研究， 最終確定甲醇-0.1%磷酸 （32 ∶68） 為分離黃獨(dú)素 B色譜條件的流動(dòng)相。 吸取黃獨(dú)素 B對(duì)照品溶液和供試品溶液各 5 μL， 注入液相色譜儀，由結(jié)果知黃獨(dú)素B的最大吸收波長為210 nm， 故確定檢測波長為 λ=210 nm。 在上述色譜條件下，供試品色譜中黃獨(dú)素B為單一色譜峰，與其他雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離。

3.3 成分定量測定 成分定量測定是藥品標(biāo)準(zhǔn)中較為重要的項(xiàng)目，限度指標(biāo)不僅是控制這種成分的量，更重要的是反映此藥品制備工藝是否規(guī)范，只有使用合格的藥材飲片通過規(guī)范的制備工藝才能達(dá)到的。限度指標(biāo)規(guī)定的太低，則使用不合格的藥材飲片或偷工減料就可以達(dá)到規(guī)定的限度成為可能，因此，定量測定規(guī)定的限度值必須合理，以達(dá)到對(duì)藥品質(zhì)量監(jiān)控的目的。考慮到黃獨(dú)素B為黃藥子毒效成分的主要代表，本實(shí)驗(yàn)規(guī)定含黃獨(dú)素 B（C19H20O6） 不得超出 0.15% ～0.50%范圍。 成分含有量過低藥材不合格，過高導(dǎo)致毒性增大，臨床應(yīng)用可控性減小。

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Quality standard for Dioscorea bulbifera L.

LIDe-bin1，2， HUANG Zhi-fang1， LIU Yun-hua1， LIU Yu-hong1， CHEN Yan1， YI Jin-hai1*
（1.Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences， Chengdu 610041， China； 2.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China）

Diosocorea bulbifera L.； diosbulbins B； quality standards； TLC； HPLC

R284.1

： A

： 1001-1528（2014）05-1037-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.033

2013-06-18

2015 版中國藥典科研計(jì)劃

李德斌 （1987—） ， 男， 碩士生， 從事中藥化學(xué)成分與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 Tel： 15928127934， E-mail： 396917203@qq.com

*通信作者： 易進(jìn)海 （1963—） ， 男， 研究員， 從事中藥化學(xué)成分與質(zhì)量評(píng)價(jià)。 Tel： （028） 85210843， E-mail： yijinhai63@163.com