吳 玉， 孫國(guó)祥， 李閆飛， 劉中博

（沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院， 遼寧 沈陽(yáng) 110016）

高效液相-乘方指紋圖譜評(píng)價(jià)防風(fēng)通圣丸質(zhì)量

吳 玉， 孫國(guó)祥*， 李閆飛， 劉中博

（沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院， 遼寧 沈陽(yáng) 110016）

目的 建立防風(fēng)通圣丸反相高效液相色譜指紋圖譜， 用多維乘方指紋圖譜評(píng)價(jià)樣品質(zhì)量。 方法 選用 Poroshell 20SB-C18色譜柱 （150mm×4.6mm， 2.7 μm） ， 流動(dòng)相為甲醇-1%冰醋酸水溶液， 體積流量 0.5mL/min， 進(jìn)樣量5 μL，柱溫 （30.0 ±0.1）℃， 檢測(cè)波長(zhǎng) 265 nm。 結(jié)果 以黃芩苷為參照物峰， 確定 59 個(gè)共有指紋峰， 以 8 級(jí)系統(tǒng)指紋定量法評(píng)價(jià)12批樣品質(zhì)量， 并測(cè)定各批次樣品中黃芩苷、 黃芩素和漢黃芩素的量。 結(jié)論 高效液相結(jié)合乘方指紋圖譜能更準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)樣品中防風(fēng)通圣丸有效成分含有量差異。

防風(fēng)通圣丸；高效液相；乘方指紋圖譜；8級(jí)系統(tǒng)指紋圖譜

中藥指紋圖譜以其綜合、宏觀、可量化特點(diǎn)被選作有效評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的重要手段，也被國(guó)際采用［1-2］。中藥指紋圖譜包括色譜 指紋圖 譜、 光譜指紋圖譜和分子生物指紋圖譜等，尤以色譜指紋圖譜應(yīng)用廣泛，但存在不足。國(guó)家藥典委員會(huì)頒布夾角余弦相似度法奠定了指紋圖譜評(píng)價(jià)基礎(chǔ)，但大峰嚴(yán)重掩蔽小峰導(dǎo)致結(jié)果失真，這對(duì)中藥質(zhì)量控制十分不利。本實(shí)驗(yàn)基于色譜指紋峰面積大小提出乘方指紋譜評(píng)價(jià)模式，旨在對(duì)中藥系統(tǒng)指紋定量鑒定進(jìn)行有益補(bǔ)充。防風(fēng)通圣丸出于金代名醫(yī)劉完素的《宣明論方》，為外散風(fēng)邪、 內(nèi)清蘊(yùn)熱的表里雙解劑， 《中國(guó)藥典》［3］收載常規(guī)檢查和鑒別， 文獻(xiàn)有防風(fēng)通圣丸藥效成 分含量分析法［4-8］。 因防 風(fēng)通圣丸含有17味藥， 化學(xué)成分十分復(fù)雜，很難全面科學(xué)地控制其質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)建立防風(fēng)通圣丸高效液相色譜指紋圖譜結(jié)合 8 級(jí)系統(tǒng)指紋定量法 （8LSQFM）， 用乘方指紋圖譜評(píng)價(jià)防風(fēng)通圣丸質(zhì)量，同時(shí)結(jié)合多組分含量測(cè)定，為中藥質(zhì)量控制提供新的評(píng)價(jià)模式。

1 乘方指紋圖譜評(píng)價(jià)模式

Sm代表宏定性相似度； SF代表定性相似度；S'F代表比率定性相似度； P8%代表 8 級(jí)宏定量相似度； α代表指紋均化性變動(dòng)系數(shù)； QF代表校正含量相似度；P代表定量相似度；C代表投影含量相似度；n 代表指紋峰數(shù)； xi，yi分別代表樣品指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜各峰的峰面積。

表1 8級(jí)系統(tǒng)指紋定量法鑒定中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Quality level assessed by 8L-SQFM

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀 器 與 試 劑 Agilent1100 型 液 相 色 譜 儀，ChemStation 工作站 （ Agilent科技有限公司）， 甲醇（色譜純， 山東禹王實(shí)業(yè)有限公司禹城化工廠），冰醋酸 （色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）， 無水乙醇 （分析純， 康科德科技有限公司），水為去離子水。 對(duì)照品黃芩苷 （baicalin），批號(hào)為110715-200514， 供含量測(cè)定用， 購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。 對(duì)照品黃芩素 （baicalein）和漢黃芩苷 （ wogonin）， 批 號(hào) 分 別 為 110705 和 111514-200403，均供含量測(cè)定用， 購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。12 批防風(fēng)通圣丸： S1 ～S12 均購(gòu)自沈陽(yáng)藥店。

2.2 樣品溶液制備 取防風(fēng)通圣丸一袋， 約 6 g，碾碎， 精密稱定， 加入 40 mL甲醇回流提取 1 h，過濾， 殘?jiān)尤?30 mL 75%乙醇再回流提取 1 h，合并兩次濾液， 減壓濃縮至約5 mL， 轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中， 用甲醇定容至刻度， 搖勻， 用 0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液作供試液。

2.3 混合對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取黃芩苷，黃芩素和漢黃芩素對(duì)照品適量，用甲醇溶解并稀釋制成黃芩苷 1.2 mg/mL、黃芩素 1.2mg/mL、 漢黃芩素 0.3 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.4 色譜條件 Poroshell120SB-C18柱 （150 mm× 4.6 mm， 2.7 μm）， 流動(dòng)相為甲醇 （A） -1.0%冰醋酸水溶液 （ B）， 梯度洗脫 （0 ～20 min， 0 ～25%A； 20 ～35 min， 25% ～40%A； 35 ～55 min，40% ～60%A； 55 ～60 min， 60% ～67%A； 60 ～80 min，67% ～100%A； 80 ～92 min， 100%A）；體積流 量 0.5 mL/min； 檢 測(cè) 波 長(zhǎng) 265 nm， 柱 溫（30 ±0.1）°C， 進(jìn)樣量 5 μL， 洗脫時(shí)間 92 min。

3 結(jié)果與討論

3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 將 S7 供試品溶液、 黃芩苷、 黃芩素和漢黃芩素對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣 5 μL，記錄色譜圖。比較保留時(shí)間和在線紫外光譜可知31、 42 和 46 號(hào)峰分別為黃芩苷、 黃芩素和漢黃芩素。 按黃芩苷記理論板數(shù)不低于 400 000， 其中黃芩苷與相鄰峰分離較好，故選黃芩苷為參照物峰。2 h空針和樣品指紋圖譜表明 92 min 內(nèi)出峰完全，無干擾， 故洗脫時(shí)間為 92 min。

3.2 方法學(xué)考察

3.2.1 精密度， 穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn) 按 “2.2”項(xiàng)下樣品溶液制備方法制備樣品，為考察儀器精密度， 取 S7 供試液連續(xù)進(jìn)樣 6 次； 分別在配制 S7 供試液后 0、6、12、 18 和 24 h， 進(jìn)樣測(cè)定以考察樣品溶液穩(wěn)定性； 平行制備 S7供試液6份進(jìn)樣測(cè)定，以參照物黃芩苷的保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，其相對(duì)保留時(shí)間 RSD均小于 2.0%， 相對(duì)峰面積 RSD均小于3.5%。 結(jié)果表明儀器精密度、樣品穩(wěn)定性和方法重復(fù)性均符合指紋譜技術(shù)要求［14］。

3.2.2 線性關(guān)系考察 精密量取混合對(duì)照品溶液0.03、 0.2、 1.0、 2.0、 5.0 mL， 分別置于 10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。將上述5個(gè)混合對(duì)照品溶液及混合對(duì)照品貯備液均進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。 以對(duì)照品質(zhì)量濃度 （mg/m L） 為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為 y=4 999.4x+191.61（r=0.999 7 ）、 y=6 983.8x+20.924 （r= 0.999 8）、 y=12 908x+205.11 （r=0.999 8）。 結(jié)果表明 3 組 分分別在 0.018 ～6.0 μg， 0.018 ～6.0 μg和 0.004 5 ～1.5 μg內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

3.2.3 加樣回收試驗(yàn) 分別制備 S7 樣品 5 份供試液，向其中加入混合對(duì)照品溶液適量，混勻，按照“2.4” 項(xiàng)色譜條件測(cè)定， 計(jì)算 3 組分的平均回收率， 分別為 103.7%、 106.2%、96.8%， RSD依次為 1.8%、1.9%、1.6%。

3.3 265 nm-HPLC指紋圖譜建立與評(píng)價(jià) 將 12 批防風(fēng)通圣丸供試液分別進(jìn)樣檢測(cè)并記錄色譜圖見圖1 （A），以黃芩苷為參照物峰， 按峰出現(xiàn)率 100%計(jì)確定59 個(gè)共有指紋峰。 將12 批樣品指紋圖譜按均值法［15］計(jì)算對(duì)照指紋圖譜 （ RFP） 并評(píng)價(jià) 12 批樣品質(zhì)量， 見表 2 正常指紋圖譜 （N-FP）， 結(jié)果 S1質(zhì)量劣 （8 級(jí)），S2 質(zhì)量一般 （6 級(jí)）， S3、 S4、S6、 S8 和 S9 質(zhì) 量 中 （5 級(jí)）， S5、 S10、 S11 和S12 質(zhì)量良好 （4 級(jí)）， S7 質(zhì)量很好 （2 級(jí)）。

圖 1 12 批防風(fēng)通圣丸-HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of the 12 batches of Fangfeng Tongsheng Pills

3.4 多維乘方指紋圖譜評(píng)價(jià)防風(fēng)通圣丸質(zhì)量 用N-FP原數(shù)據(jù) 計(jì)算 S-FP、 1.5PFP、 ST-FP和 CT-FP如圖 1 （B-E）。 S-FP和 1.5PFP有效地突出了大峰權(quán)重，但忽略小峰貢獻(xiàn)，乘方次數(shù)越高越顯著。ST-FP和 CT-FP則相反， 均突出小峰貢獻(xiàn)而降低大峰權(quán)重，使大小峰均化，開方次數(shù)越大越明顯。評(píng)價(jià)結(jié)果見表 2， 在正常指紋圖譜 （N-FP） 評(píng)價(jià)結(jié)果中， S7 質(zhì)量等級(jí)最高 （2 級(jí)）， 表明 S7 質(zhì)量最好，同時(shí)在其他四種圖譜處理方法中 S7 對(duì)應(yīng)的質(zhì)量等級(jí)均為最高，由此可見乘方指紋圖譜可以準(zhǔn)確評(píng)價(jià)樣品質(zhì)量。

表 2 評(píng)價(jià) 12 批防風(fēng)通圣丸質(zhì)量結(jié)果Tab.2 Evaluation results of 12 batches of FFTSPs

3.5 樣品測(cè)定 12 批防風(fēng)通圣丸樣品 3 成分測(cè)定結(jié)果見表 3， 黃芩苷為 0.34 ～5.06 mg/g， 黃 芩 素為 0.30 ～4.29 mg/g， 漢 黃 芩 素 為 0.19 ～ 0.75 mg/g。 其中在 S1 中黃芩素和漢黃芩素均未檢出， 定量指紋圖譜評(píng)價(jià) S1的質(zhì)量為劣， 兩種評(píng)價(jià)方法結(jié)果一致。

表 3 12 批防風(fēng)通圣丸中 3 成分測(cè)定結(jié)果Tab.3 Determ ination of three constituents in 12 batches of Fangfeng Tongsheng Pills

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了 265 nm時(shí)防風(fēng)通圣丸的 N-FPs、S-FPs、 1.5PFPs、 ST-FPs和 CT-FPs多維乘方指紋圖譜， 采用 8級(jí)系統(tǒng)指紋定量法評(píng)價(jià) 12 批樣品質(zhì)量。 N-FP能準(zhǔn)確反映防風(fēng)通圣丸成分含有量特征、指紋均一性及內(nèi)在總指紋成分含有量變化，但可能存在大峰掩蔽小峰現(xiàn)象，因此采用多維乘方指紋圖譜綜合評(píng)價(jià)12批防風(fēng)通圣丸質(zhì)量。 開方指紋圖譜能消除大峰掩蓋小峰效應(yīng)，高方次指紋圖譜則突出大峰作用。多組分定量測(cè)定作為輔助評(píng)價(jià)方法，比較測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同批次樣品中黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的量不同，這可能是由于生產(chǎn)工藝或生產(chǎn)過程中的差異導(dǎo)致的，也可能是由于源藥材產(chǎn)地等的影響。指紋圖譜可以從整體上評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量，與多組分定量測(cè)定相結(jié)合，可以更準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)樣品中有效成分含有量差異。比較指紋圖譜評(píng)價(jià)結(jié)果和含量測(cè)定結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)兩種方法互為補(bǔ)充，相輔相成，為中藥指紋圖譜評(píng)價(jià)及中藥現(xiàn)代化提供了新思路。

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Evaluation of Fangfeng Tongsheng Pills by HPLC com bined w ith involution fingerprint

WU Yu， SUN Guo-xiang*， LIYan-fei， LIU Zhong-bo
（College of Pharmacy， Shenyang Pharmaceutical University， Shenyang 110016， China）

AIM To establish RP-HPLC fingerprint of Fangfeng Tongsheng Pills， and evaluate the quality of Fangfeng Tongsheng Pills by involution fingerprint.METHODS The analysis was performed on Poroshell 20SBC18column （150 mm×4.6 mm，2.7 μm） and column temperaturemaintained at（30.0 ±0.1）℃， and methanol-1.0%glacial acetic acid waterwas used asmobile phase， the flow rate of0.5mL/min and the sample injection size of 5 μL were adopted.Wavelength was set at 265 nm.RESULTS Choosing baicalin peak as the reference peak and 59 fingeprint peakswere identified.Assessment of the 8th level systematically quantified fingcrprintmethod based on RP-HPLC combined with involution fingerprint was used for twelve batches of Fangfeng Tongsheng Pills.CONCLUSION RP-HPLC combined with involution fingerprintmethod can well reflect the quantity of Fangfeng Tongsheng Pills.

Fangfeng Tongsheng Pills； HPLC； involution fingerprint； the 8th level systematically quantified fingerprintmethod

R284.1

： A

： 1001-1528（2014）05-1021-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.029

2013-06-18

國(guó)家自然科學(xué)基金重大研究計(jì)劃課題 （90612002）

吳 玉 （1980—） ， 女， 碩士， 研究方向： 中藥指紋圖譜。 Tel： 13591645073， E-mail： wuyuwuyu1990@163.com

*通信作者： 孫國(guó)祥 （1962—）， 男， 博士， 教授， 博士生導(dǎo)師， 研究方向： 中藥指紋學(xué)體系及其信息學(xué)。 Tel：（024）23986286， E-mail： gxswmwys@163.com