郭玉東， 胡宇馳， 曹春然， 王志斌*， 周建平， 左澤平， 高 陽(yáng)， 王碧松

（1.北京市藥品檢驗(yàn)所， 北京 100035； 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理系， 北京 100102）

舒血寧注射液體外抑制血小板聚集的生物活性測(cè)定法

郭玉東1， 胡宇馳1， 曹春然1， 王志斌1*， 周建平1， 左澤平1， 高 陽(yáng)2， 王碧松1

（1.北京市藥品檢驗(yàn)所， 北京 100035； 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理系， 北京 100102）

目的 建立舒血寧注射液 （銀杏葉提取物） 體外抑制血小板聚集的生物活性測(cè)定法用于補(bǔ)充其質(zhì)量控制方法。方法 以抑制家兔血小板聚集作用來(lái)考察顯示舒血寧注射液量效關(guān)系和效價(jià)測(cè)定。結(jié)果 舒血寧注射液對(duì)凝血酶和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集無(wú)明顯的抑制作用， 效價(jià)測(cè)定為 100 U/mL。 結(jié)論 舒血寧注射液抑制血小板聚集的生物活性測(cè)定法可靠，重復(fù)性良好，穩(wěn)定性較好，可作為質(zhì)量控制。

舒血寧注射液；血小板聚集；生物活性測(cè)定法；質(zhì)量控制

舒血寧注射液為銀杏葉提取物制劑，通過(guò)長(zhǎng)期的研究，藥理機(jī)制和臨床應(yīng)用都得到了廣泛認(rèn)可、全面認(rèn)識(shí)和深入研究。 北京市藥品檢驗(yàn)所在 2009年國(guó)家中藥注射劑評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)不同生產(chǎn)企業(yè)的舒血寧注射液質(zhì)量存在差異，表明現(xiàn)行的質(zhì)量控制方法存在一定缺陷。金納多注射液與舒血寧注射液主要成分相同，僅生產(chǎn)工藝有所差異，在本研究中作為對(duì)照。

中藥成分復(fù)雜，而單一的控制少數(shù)指標(biāo)性成分難以控制藥物的有效性和安全性，這就迫使我們對(duì)現(xiàn)有的中藥質(zhì)量控制方法進(jìn)行改進(jìn)［1］。 生物檢定法最近幾年日趨成熟，并且在某些西藥質(zhì)量控制中生物檢定法已經(jīng)占據(jù)了主導(dǎo)地位， 《中國(guó)藥典》2010 年版一部中， 增加了中藥的生物活性測(cè)定研究指導(dǎo)原則［3］， 說(shuō)明在中藥尤其是中藥注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增訂生物活性測(cè)定項(xiàng)，已經(jīng)是一種方向［2］。 如果能夠率先在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中制定生物活性測(cè)定項(xiàng)，必將大大推動(dòng)中藥的發(fā)展，使其有質(zhì)的飛躍。因此生物活性測(cè)定法用于中藥質(zhì)量控制已是一種必然的趨勢(shì)。

前期藥效學(xué)研究發(fā)現(xiàn)舒血寧注射在體內(nèi)外對(duì)血小板聚集均具有較好的抑制作用，并且具有明確的劑量依賴關(guān)系，因此本實(shí)驗(yàn)嘗試建立舒血寧注射液體外抑制血小板聚集的生物活性測(cè)定法，量化舒血寧注射液的活血化瘀作用，對(duì)其質(zhì)量控制方法進(jìn)行補(bǔ)充，更好的指導(dǎo)舒血寧注射液的臨床使用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級(jí)日本大耳白家兔， 許可證號(hào) SCXK （ 京）2006-0009，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 5 μmol/L二磷酸腺苷 （ADP， 北京世帝科學(xué)儀器公司）； 凝血酶 （中國(guó)藥品生物制品檢定所），批號(hào) 140605-200824； 血小板活化因子 （PAF） （ACROS），批號(hào) A0208208001； 0.9%氯化鈉注射液 （中國(guó)大冢制藥有限公司）， 批號(hào)0B72H2； 枸櫞酸納 （北京化學(xué)試劑公司）， 批號(hào)20080904； 滅菌注射用水 （大同市惠達(dá)藥業(yè)有限責(zé)任公司），批號(hào) 0907261。 金納多注射液 （5mL/支）， 批號(hào) D2118； 舒血寧注射液 （5 m L/支）， 批號(hào) 100707。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 LG-PABER-Ⅰ型血小板聚集凝血因子分析儀 （北京世帝科學(xué)儀器公司）， DT5-1 離心機(jī) （北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）， MEK-6318 血液分析儀 （北京健長(zhǎng)醫(yī)療器械有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 血漿制備 家兔采取頸總動(dòng)脈放血 75 mL，加 3.8%枸櫞酸納 （1 ∶9） 抗凝， 1 000 r/min 離心10 min 制備富血小板血漿 （PRP）， 剩余血樣繼續(xù)3 500 r/min 離 心 10 min 制 備 貧 血 小 板 血 漿（PPP）。

用血液分析儀測(cè)定 PPP和 PRP中的血小板數(shù)，PPP中血小板數(shù)一般在 5 ×109個(gè)/L以下， 利用PPP調(diào)節(jié) PRP中的血小板數(shù)在 4.0 ×1012～4.5 × 1012個(gè) /L之間［4］，為保證測(cè)量的準(zhǔn)確性， 血小板聚集的測(cè)定應(yīng)在4 h 內(nèi)完成， 且PRP不可冷凍保存和過(guò)度震蕩［5］。

2.2 測(cè)試樣品配制 取金納多注射液 1 支，用0.9%的生理鹽水分別配制成劑間比為 0.85， 配制梯度為 85%、 72%、 61%、 52%、 44%的樣品液各1 mL， 作為對(duì)照品， 取舒血寧注射液 1 支， 用0.9%的生理鹽水分別配制劑間比為 0.85， 配制梯度為 85%、 72%、61%、 52%、 44%的樣品液各1 m L， 為供試品。

2.3 血小板聚集測(cè)定 取 PPP 210 μL加入測(cè)試杯， 進(jìn)行儀器調(diào)零。 再取 PRP180 μL［6-7］， 分別加入不同質(zhì) 量分?jǐn)?shù) 的 樣 品 液 20 μL，37 ℃ 孵 育 180 s［8］， 分別加入聚集誘導(dǎo)劑 10 μL， 測(cè)定 5 min內(nèi)的最大聚集率［9］。

2.4 舒血寧注射液生物活性測(cè)定

2.4.1 量效關(guān)系考察 取舒血寧、 金納多注射液，用 0.9%氯化鈉注射液精確稀釋為含舒血寧、 金納多注射液 44%、 52%、 61%、 72%、 85%和 100%（原液） 的 6個(gè)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)稀釋液， 劑間比為0.85， 依 “2.3”項(xiàng)下方法，分別測(cè)定含藥血漿的血小板最大聚集率。

2.4.2 效價(jià)測(cè)定 取金納多注射液， 用 0.9%氯化鈉注射液精確稀釋為含金納多注射液 72%、85%和 100% （原液） 的 3 個(gè)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)稀釋液， 劑間比 0.85，作為對(duì)照品組 （S）； 取舒血寧注射液， 用 0.9%氯化鈉注射液精確稀釋為含舒血寧注射液72%、 85%和100% （原液） 的3 個(gè)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)稀釋液， 劑間比 0.85， 作為供試品組（T）。依 “2.3” 項(xiàng)下方法， 分別測(cè)定對(duì)照品組和供試品組含藥血漿的血小板最大聚集率。 按照 S1、T1、 T2、 S2、 S3、 T3 的順序 （排除因 S 組和 T組測(cè)定的先后次序引起的誤差）， 平行測(cè)定3次。 按《中國(guó)藥典》 生物檢定統(tǒng)計(jì)法中量反應(yīng)平行線三三法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，考察結(jié)果的可靠性，計(jì)算T組的效價(jià) （PT） 和可信限率 （FL%）。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 量效關(guān)系考察結(jié)果 由前期預(yù)試發(fā)現(xiàn)， 舒血寧注射液與金納多注射液均對(duì)凝血酶和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集無(wú)明顯的抑制作用，因此實(shí)驗(yàn)中只選擇ADP和 PAF兩種誘導(dǎo)劑進(jìn)行試驗(yàn)。 以對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后血小板最大聚集率為縱坐標(biāo)，藥物百分含有量為橫坐標(biāo)， 結(jié)果見(jiàn)表1 ～2。 由于血小板最大聚集率經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后與藥物百分含有量所成的線性關(guān)系，較不轉(zhuǎn)換前線性更好，相關(guān)系數(shù)更高，因此考察線性關(guān)系和計(jì)算效價(jià)時(shí)均對(duì)血小板最大聚集率進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。

表1 舒血寧注射液對(duì)不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的血小板最大聚集率的影響Tab.1 Effect of Shuxuening Injection on platelet maximum aggregation rate induced by different inducers

表2 金納多注射液對(duì)不同誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的血小板最大聚集率的影響Tab.2 Effect of Jinnaduo Injection on plateletmaximum aggregation rate induced by different inducers

由表1～2可以看出對(duì)于 ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，舒血寧注射與金納多注射液的抑制作用無(wú)明顯差別， 對(duì)于 PAF誘導(dǎo)的血小板聚集， 金納多注射液的抑制作用較強(qiáng)于舒血寧注射液。

對(duì)表1～2數(shù)據(jù)中藥物濃度與對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的血小板最大聚集率進(jìn)行線性考察，發(fā)現(xiàn)舒血寧注射液與金納多注射液對(duì)ADP和 PAF誘導(dǎo)的血小板聚集，均有較好的線性關(guān)系 （r2均大于 0.96）， 其中對(duì)于PAF誘導(dǎo)的聚集兩種注射液所得線性關(guān)系更好， r2均大于0.99， 由此可見(jiàn)舒血寧注射液與金納多注射液對(duì)ADP和 PAF誘導(dǎo)血小板聚集均有較好的抑制作用，并成劑量依賴性，隨著藥物濃度的增大，其抑制作用越強(qiáng)，血小板聚集率越低。

3.2 效價(jià)測(cè)定與可靠性考察 由于金納多注射液在 《中國(guó)藥典》 2010 年版及國(guó)外藥典上未見(jiàn)效價(jià)的規(guī)定， 因此假設(shè)對(duì)照品 （S） 金納多注射液的效價(jià)為 100 U/mL， 由于舒血寧注射液與金納多注射液成分相同，且基本成分的含有量也相同，如果舒血寧注射液抑制血小板聚集的效果與金納多相同，則其測(cè)得效價(jià)也應(yīng)為 100 U/mL， 結(jié)果見(jiàn)表 3。

表3 舒血寧注射液由 ADP、 PAF誘導(dǎo)的測(cè)得效價(jià)與可信限率Tab.3 M easured titer and rate of confidence lim it of Shuxuening Injection induced by ADP and PAF

由表4和表5可靠性檢驗(yàn)得，兩種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的血小板聚集可靠性檢驗(yàn)均合格， 回歸顯著 （P＜0.01）， 偏離平行、 二次曲線、 反向二次曲線均不顯著 （P＞0.05）， 可信限率均小于 10%， 以上結(jié)果表明該方法得到的測(cè)得效價(jià)可靠。其中舒血寧ADP誘導(dǎo)的測(cè)得效價(jià)與金納多相差較小，且試品間可靠性檢驗(yàn)無(wú)顯著性差異 （P＞0.05）， 說(shuō)明對(duì)于ADP誘導(dǎo)的血小板聚集， 舒血寧注射液的抑制作用與金納多差別不明顯。 舒血寧 PAF誘導(dǎo)的測(cè)得效價(jià)與金納多相差較大，并比金納多小，且試品間可靠性檢驗(yàn)有顯著性差異 （P＜0.01），進(jìn)一步驗(yàn)證了對(duì)于 PAF誘導(dǎo)的血小板聚集， 金納多注射液的抑制作用強(qiáng)于舒血寧注射液。由以上結(jié)果可以看出，雖然舒血寧注射液與金納多注射液主要成分含有量相同，但測(cè)得效價(jià)卻不相同，說(shuō)明兩種注射劑質(zhì)量存在一定差異。

表4 舒血寧注射液由 ADP誘導(dǎo)效價(jià)測(cè)定的可靠性檢驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of reliability test of titer determ ination of Shuxuening Injection induced by ADP

表5 舒血寧注射液由 PAF誘導(dǎo)效價(jià)測(cè)定的可靠性檢驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of reliability test of titer determ ination of Shuxuening Injection induced by PAF

3.3 重復(fù)性考察 取同一血漿為試驗(yàn)系， 按照血小板聚集的測(cè)定方法，測(cè)定舒血寧注射液相對(duì)金納多注射液相對(duì)生物效價(jià)，重復(fù)測(cè)定6次，并進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表6 ～7。

由表 6 ～7 可見(jiàn)，舒血寧注射液經(jīng) ADP、 PAF誘導(dǎo)的血小板聚集的相對(duì)生物效價(jià)，6次分別測(cè)定結(jié)果的可靠性檢驗(yàn)均合格， 回歸顯著 （P＜0.01），偏離平行、二次曲線、反向二次曲線均不顯著（P＞0.05），可信限率均小于10%， 測(cè)得效價(jià)平均值的 RSD均小于5%， 因此說(shuō)明用血小板聚集的方法測(cè)定出舒血寧注射液的生物效價(jià)方法可靠，重復(fù)性較好，具有一定的可行性。

表6 舒血寧注射液對(duì) ADP誘導(dǎo)血小板聚集的相對(duì)生物效價(jià)重復(fù)性考察Tab.6 Relative biological titer reproducibility of platelet aggregation in b lood of Shuxuening Injection induced by ADP

表7 舒血寧注射液對(duì) PAF誘導(dǎo)血小板聚集的相對(duì)生物效價(jià)重復(fù)性考察Tab.7 Relative biological titer reproducibility of p latelet aggregation in b lood of Shuxuening Injection induced by PAF

4 結(jié)論

由上述結(jié)果可以看出， 舒血寧注射液對(duì) ADP、PAF誘導(dǎo)的體外血小板聚集有較好的抑制作用， 并且劑量依賴性明顯。通過(guò)線性關(guān)系考察發(fā)現(xiàn)，均具有良好的線性關(guān)系，可靠性檢驗(yàn)均合格表明該方法得到的測(cè)得效價(jià)可靠。重復(fù)性考察表明，建立的兩種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)體外血小板聚集的生物檢定方法學(xué)，重復(fù)性較好，測(cè)定出舒血寧注射液的生物效價(jià)可靠，具有一定的可行性，可以進(jìn)行深入的研究。

由于舒血寧注射液和金納多注射液主要成分含有量相同，建立的舒血寧注射液的生物效價(jià)方法可靠，如果兩種注射劑療效相同，則測(cè)得效價(jià)應(yīng)無(wú)差別，但實(shí)際測(cè)的效價(jià)差異較大，說(shuō)明兩種注射劑的質(zhì)量存在一定差異，這也進(jìn)一步說(shuō)明單從成分控制舒血寧的質(zhì)量存在缺陷，需要進(jìn)一步提高。

目前中藥生物活性測(cè)定法還處在起步階段［10-11］， 該方法的關(guān)鍵 問(wèn)題是 指標(biāo)和對(duì)照品確立，由于目前舒血寧注射液還沒(méi)有對(duì)照品，因此本實(shí)驗(yàn)選擇與舒血寧注射液同質(zhì)的金納多注射液作為標(biāo)準(zhǔn)品，并假定其效價(jià)，測(cè)定舒血寧注射液的效價(jià)。如果能夠建立一批針對(duì)抑制血小板聚集活性的舒血寧注射液 對(duì)照 品， 并通 過(guò) 協(xié) 作標(biāo) 定［12-14］， 確 定 其 穩(wěn)定性，必將極大的推進(jìn)舒血寧注射液生物活性測(cè)定法進(jìn)步，真正意義上量化其活性，規(guī)定合格范圍，控制舒血寧注射液的質(zhì)量。

測(cè)定體外血小板聚集實(shí)驗(yàn)時(shí)， 離心完的 PRP與 PPP血漿一定要用血液分析儀測(cè)定其血小板數(shù)，盡量保證每次實(shí)驗(yàn) PRP血漿中的血小板數(shù)基本相同， 若 PRP中的血小板數(shù)過(guò)高， 可以用 PPP進(jìn)行調(diào)節(jié)；過(guò)低時(shí)可降低離心的轉(zhuǎn)速，以保證血小板數(shù)在合適范圍內(nèi)。制備好的血漿最好在4 h內(nèi)完成測(cè)定，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)血漿的穩(wěn)定性會(huì)下降。操作過(guò)程中避免過(guò)度震蕩，過(guò)度震蕩也會(huì)使血漿的穩(wěn)定性下降，避免冷藏，低溫會(huì)加速血小板聚集，以上操作均能使測(cè)量結(jié)果有較大的誤差，操作過(guò)程中應(yīng)當(dāng)注意。

影響體外血小板聚集實(shí)驗(yàn)的因素較多，為了保證每次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，不同實(shí)驗(yàn)室均應(yīng)按照此操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有可比性，加快該方法在不同實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。

由于舒血寧注射液體外抗血小板聚集的實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、費(fèi)用低，便于建立的生物活性測(cè)定方法［15］， 利于在藥檢部門(mén)推廣。 該方法對(duì)舒血寧注射液的質(zhì)量控制方法進(jìn)行了很好的補(bǔ)充，使其質(zhì)量控制方法更加完善，保證其臨床使用的安全有效。由于活血化瘀類注射劑多具有抑制血小板聚集的作用，可以嘗試著將這種方法在該類注射劑質(zhì)量控制中應(yīng)用，為中藥質(zhì)量控制方法提供新的思路。

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Bioassay m ethod of Shuxuening Injection to inhibit p latelet aggregation

GUO Yu-dong1， HU Yu-chi1， CAO Chun-ran1， WANG Zhi-bin1*， ZHOU Jian-ping1，ZUO Ze-ping1， GAO Yang2， WANG Bi-song1
（1.Beijing Institute for Drug Control， Beijing 100035， China； 2.Department of Chinese Herbal Pharmacology， Beijing University of ChineseMedicine，Beijing 100102， China）

AIM To establish a bioassaymethod of Shuxuening Injection （Ginko Folium） to inhibit the plateletaggregation for the supplementary of its quality control.METHODS The pharmacological activity of platelet aggregation of rabbit blood was used for the examination of dose-effect relationship and titer of Shuxuening Injection.RESULTS The inhibitory effect of Shuxuening Injection on platelet aggregation induced by thrombin and gelatin was not distinct，and the determined titer was 100 U/mL.CONCLUSION The bioassay method of platelet aggregation of Shuxuening Injection is reliable with good reproducibility and stability，and can serve as its quality control to some extent.

Shuxuening Injection； platelet aggregation； bioassaymethod； quality control

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）05-1008-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.027

2013-05-11

郭玉東 （1984—） ， 男， 主管藥師， 碩士， 主要從事藥品安全性評(píng)價(jià)試 驗(yàn)。 Tel： （010） 83288837， E-mail： guoyudong23@ 126.com

*通信作者： 王志斌， 研究員， 主要從事藥品標(biāo)準(zhǔn)及藥物活性研究。 Tel： （010） 83220757 ， E-mail： wangzhibin4804@sina.com