朱平川， 岑衛(wèi)健， 范曉蘇

（1.廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣西 南寧 530004； 2.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 廣西 南寧 530004）

UPLC-MS/MS法測(cè)定咳速停糖漿中 3 種興奮劑類生物堿

朱平川1， 岑衛(wèi)健1， 范曉蘇2

（1.廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣西 南寧 530004； 2.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 廣西 南寧 530004）

目的 建立同時(shí)測(cè)定咳速停糖漿中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿以及磷酸可待因3種有效成分的量的超高效液相色譜-串聯(lián) 質(zhì) 譜 （ UPLC-MS/MS ） 分 析 方 法。 方 法 用 Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus C18（ 50 mm ×2.1 mm，1.8 μm） 色譜柱， 以甲醇-0.1%甲酸的水溶液為流動(dòng)相， 體積流量 0.30 mL/min。 在 電噴霧 電離 （ ESI） 正離子 模式下， 采用的是多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式 （MRM） 進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果 鹽酸麻黃堿、 鹽酸偽麻黃堿以及磷酸可待因的線性范圍分別為 0.001 6 ～4.5mg/L、 0.000 8 ～4.8mg/L、 0.004 ～2.0mg/L； 檢出限分別為 0.8 μg/L、 0.4 μg/L、 1.2 μg/L； 3種成分的加樣回收率為 91.1% ～104%； 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于 2.6%。 結(jié)論 該方法簡便、 準(zhǔn)確、 快速、 靈敏度高，已成功地用于實(shí)際的樣品分析。

咳速停糖漿； 生物堿； 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜 （UPLC-MS/MS）

咳速停糖漿由觀音草、黃精、白尾參、桔梗、 麻黃、罌粟殼、桑白皮等多味苗族藥組成，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰，潤肺止咳，益胃生津的功效。主要用于感冒及慢性支氣管炎引起的咳嗽、咽干、咯痰、氣喘。處方中所含的鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、磷酸可待因?qū)儆趶?qiáng)成癮性物質(zhì)，歸屬于興奮劑類物質(zhì)，但同時(shí)也是有效成分。為確保制劑的有效性及安全性，必須控制成分含有量。已有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的測(cè)定有高效液相色譜法［1-2］、毛細(xì)管電 泳 法［3-4］，對(duì) 磷 酸 可 待 因 的 檢 測(cè)主要是高效液相色譜法［5］、 毛細(xì)管電泳法［6］、 液質(zhì)聯(lián)用法［7］， 但采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定咳速停糖漿中的鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、磷酸可待因這3種物質(zhì)的分析方法尚未見報(bào)道。

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有專屬靈敏、 快速等特點(diǎn)， 已成功用于成分測(cè)定［8-10］， 更是成分分析 中定性和定量分析的 有 力 工 具［11-15］。 液 相 色 譜-質(zhì) 譜 聯(lián)用技術(shù)具有專屬靈敏、快速等特點(diǎn)，是中藥成分分析中定性和定量分析的有力工具［16］， 本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)檢測(cè)這3種物質(zhì)含有量的方法，該方法準(zhǔn)確、簡便快速，已成功地用于實(shí)際樣品的分析。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器 1290 Infinity LC System， 6460 Triple Quad LC/MS， 美國 Agilent公 司； Synthesis A10TM超純水系統(tǒng)， 美國 Millipore公司； Eppendorf Centrifuge 5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國 Eppendorf公司； KQ2200DV超聲波清洗器， 昆山市超聲儀器有 限 公 司， ME 215S 電 子 天 平， 德 國 Sartorius公司。

1.2 試劑 甲醇、 乙腈、 甲酸 （色譜純）， 美國Fisher公司； 對(duì)照品鹽酸麻黃堿、 鹽酸偽麻黃堿、 磷酸可待因，購自中國藥品生物制品檢定所；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；樣品咳速停糖漿，貴州白靈制藥有限公司生產(chǎn)， 批號(hào)分別為 A20120602、A20120801、A20120607。

2 方法與結(jié)果

2.1 色 譜 條 件 采 用 C18色 譜 柱 （2.1 mm × 50 mm， 1.8 μm）；以甲醇 （A） -0.1%甲酸水（B） 為流動(dòng)相， 梯度洗脫 （0 ～2 min， 95%B；2 ～6min， 95%B～93%B； 6 ～8 min， 93%B～ 80%B； 8.0 ～9.0 min， 80%B～10%B； 9.0 ～10 min， 10%B～0%B； 10 ～12min， 0%B～95% B）； 體積流量 0.30 mL/min； 進(jìn)樣體積 1 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離源 （ESI） 正離子模式， 多重反應(yīng)檢測(cè)模式 （MRM模式）。 霧化氣為氮?dú)猓?壓力是 2.8 ×105Pa； 鞘氣為氮?dú)猓?溫度是 360 ℃， 體積流量 12 L/min。干燥氣為氮?dú)猓瑴囟仁?350 ℃， 體積流量 10 L/min。 毛細(xì)管電壓4 000 V， 噴嘴電壓 0 V。 3 種目標(biāo)組分的其他質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 3種成分的部分質(zhì)譜分析參數(shù)Tab.1 MS analysis on parameters of three components

2.3 對(duì)照品溶液的配制 準(zhǔn)確稱取鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、 磷酸可待因?qū)φ掌犯?10.0 mg， 置于10 mL量瓶中， 用甲醇溶解并定容。 對(duì)照品貯備液的質(zhì)量濃度為 1.00 g/L， 于 4 ℃下保存， 使用前用甲醇稀釋到所需的質(zhì)量濃度。

2.4 樣品溶液的配制 準(zhǔn)確量取咳速停糖漿1 m L， 置于 1.5 mL的 EP管中， 12 000 r/min 離心10 min， 將上清液置于另一個(gè) 1.5 mL的 EP管中，用甲醇稀釋至 500 mL， 經(jīng) 0.22 μm的微孔濾膜過濾即可作為樣品溶液。

2.5 線性關(guān)系及檢出限 分別吸取各對(duì)照品貯備液適量， 以甲醇稀釋配置質(zhì)量濃度為 0.001 6、0.008、 0.04、 0.2、 1、 2、 4.5 mg/L鹽酸麻黃堿系列溶 液，0.000 8、 0.001 6、 0.008、0.04、0.2、1、 2、 4.8 mg/L鹽酸偽麻黃堿系列溶液， 0.004、0.01、 0.05、 0.1、 0.5、 1、 2 mg/L磷酸可待因系列溶液，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定，重復(fù)3次。以被測(cè)組分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積的平均值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸， 以信噪比 （S/N） 等于 3 為標(biāo)準(zhǔn)， 測(cè)得3種待測(cè)組分的檢出限， 見表 2， 從表中可看出，各化合物的響應(yīng)值與質(zhì)量濃度間均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表2 3種組分的線性方程、 相關(guān)系數(shù)、 線性范圍及檢出限Tab.2 Regression equations， linear ranges， correlation coefficients（ r2） and detection lim its of three com ponents

2.6 精密度、 穩(wěn)定性以及重復(fù)性 精密吸取對(duì)照品貯備液各 10 μL， 混合稀釋至 10 mL， 配置成含鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、磷酸可待因各1 mg/L的對(duì)照品混合液， 在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下連續(xù)進(jìn) 樣 6 次 測(cè) 定， 相 對(duì) 標(biāo) 準(zhǔn) 偏 差 （RSD） 為0.92% ～1.5%， 結(jié)果表明該儀器精密度良好。

取同一批次樣品， 按 “2.4” 項(xiàng)制備樣品溶液， 在優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)條件下， 分別于 0、 2、4、6、8、 10 h 進(jìn)樣 測(cè)定， 相對(duì)標(biāo) 準(zhǔn)偏差 （ RSD） 為1.1% ～1.8%， 結(jié)果表明供試品溶液在 10 h 內(nèi)穩(wěn)定。

同一批次待測(cè)樣品隨機(jī)取 6 份，按 “2.4” 項(xiàng)制備樣品溶液，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下分析，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD） 為 1.1% ～2.3%。 結(jié)果表明供試樣品重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密量取已知這 3 種組分含有量的同一批次咳速停糖漿各 1 mL， 共 9份， 每組 3 份， 按 “2.4” 項(xiàng)方法將樣品稀釋 500倍來制備樣品溶液，加入高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品。在最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)樣測(cè)定，3種成分的平均回收率見表3。 在添加3個(gè)質(zhì)量濃度的水平下， 3 種成分的加樣回收率為 91.1% ～104%， RSD均不大于 2.6%， 可以滿足實(shí)際樣品的測(cè)定要求。

表 3 3 種組分在樣品中的加樣回收率 （n=3）Tab.3 Results of recovery tests of three com ponen ts in sam p les（n=3）

2.8 樣品分析 分別精密稱取不同批次的樣品，按 “2.4” 項(xiàng)制備樣品溶液， 按上述優(yōu)化好的條件進(jìn)行樣品測(cè)定， 結(jié)果見表4。 對(duì)照品及樣品的分離情況見圖1， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 該方法可用于鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、磷酸可待因3種有效成分的同時(shí)測(cè)定。

圖1 對(duì)照品 （A） 和樣品 （B） 的 MRM色譜圖Fig.1 M ultip le reaction monitoring chromatogram s of three reference substances（A） and sample（B）

表4 樣品測(cè)定結(jié)果Tab.4 Results of sam p le analysis

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水和乙腈-水流動(dòng)相體系，結(jié)果表明使用甲醇-水體系作流動(dòng)相時(shí)靈敏度高于乙腈-水體系，且分離效果更好。在流動(dòng)相中不添加甲酸時(shí)，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿兩個(gè)物質(zhì)峰未能達(dá)到基線分離，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步比較3種物質(zhì)在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)甲酸水（0.1%、0.2%、 0.3%、 0.4%） 條 件 下 的 靈 敏度， 結(jié)果表明， 0.1%甲酸水最有利于提高靈敏度。3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 分別對(duì)正離子和負(fù)離子檢測(cè)模式進(jìn)行了比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采用正離子模式檢測(cè)這3種物質(zhì)的檢測(cè)靈敏度較高。對(duì)選定的各待測(cè)物的母離子和定量子離子， 在 MRM模式下進(jìn)行各種參數(shù)的優(yōu)化， 結(jié)果見表1。

4 結(jié)論

采用 UPLC-MS/MS 技術(shù)建立了同時(shí)測(cè)定咳速停糖漿中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、磷酸可待因3種成分的分析方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法靈敏度高、定量能力強(qiáng)，準(zhǔn)確、快速、簡單。該方法的建立有利于進(jìn)一步完善咳速停糖漿及其類方的質(zhì)量控制及藥代動(dòng)力學(xué)、藥物療效等相關(guān)研究。

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Sim ultaneous determ ination of three stim ulant alkaloids in Kesuting Syrupy by UPLC-MS/MS

ZHU Ping-chuan1， CENWei-jian1， FAN Xiao-su2
（1.State Key Laboratory of Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources， Guangxi University， Nanning 530004， China； 2.School of Chemistry and Chemical Engineering， GuangxiUniversity， Nanning 530004， China）

AIM A method for simultaneous determination of ephedrine hydrochloride， pseudoephedrine hydrochloride and codeine phosphate in Kesuting Syrupy was established by ultra performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry（ UPLC-MS/MS） .M ETHODS The UPLC separation was performed on a Zorbax RRHD Eclipse Plus C18column （ 2.1 mm× 50 mm， 1.8 μm） by using methanol and water which contained 0.1%formic acid asmobile phase with the gradient elution at a flow rate of 0.30 m L/min.The analytes were detected by tandem mass spectrometry under the positive ionmode with the ESIsource and carried out in the multiple reaction monitoring（ MRM） mode.RESULTS Under the optimum conditions， the calibration curves were linear in the range of 0.001 6-4.5 mg/L for ephedrine hydrochloride， 0.000 8-4.8 mg/L for pseudoephedrine hydrochloride， 0.004-2.0 mg/L for codeine phosphate.The detection limitswere 0.8， 0.4， 1.2 μg/L， respectively.The average recoveries of the three effective componentswere between 91.1%and 104%with all relative standard deviations notmore than 2.6%.CONCLUSION The developedmethod is simple， rapid and accurate， and suitable for the quality control of the three components in Kesuting Syrupy.

Kesuting Syrupy； alkaloid； ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）

R927.2

： A

： 1001-1528（2014）05-0970-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.019

2013-08-19

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （桂科自0832034）； 廣西大學(xué)科研基金項(xiàng)目 （DD703003）

朱平川 （1982—） ， 女， 實(shí)驗(yàn) 師， 從 事 色 譜、 質(zhì) 譜 及 其 聯(lián) 用 方 法 的 研 究。 Tel： （ 0771 ） 3237743， E-mail： zhupingchuan12@ 163.com