徐春蕾， 薛 平， 吳玉蘭， 張 芳， 李 祥*

（1.南京中醫(yī)藥大學藥學院， 江蘇 南京 210023； 2.常州藥品檢驗所， 江蘇 常州 213003）

三白草酮及衍生物的溶解性和保肝活性研究

徐春蕾1， 薛 平2， 吳玉蘭1， 張 芳1， 李 祥1*

（1.南京中醫(yī)藥大學藥學院， 江蘇 南京 210023； 2.常州藥品檢驗所， 江蘇 常州 213003）

目的 考察三白草酮及衍生物的溶解性和保肝活性。 方法 采用 HPLC測定三白草酮及衍生物在常用溶劑中的溶解度和正辛醇-水/緩沖液體系中的表觀脂水分配系數(shù) （P）； 采用 CCl4小鼠肝損傷模型考察其保肝活性。 結果25 ℃時三白草酮及衍生物 A、 B、 C在水中的溶解度分別為 （0.161 ±0.007）， （12.4 ±0.57）， （0.145 ±0.006），（0.667 ±0.031） mg/L； 在正辛醇 /水中的 lgP分別為 （3.32 ±0.13）， （2.63 ±0.08）， （3.28 ±0.08）， （2.76 ±0.09）；衍生物A的保肝降酶活性較三白草酮有所提高，衍生物B與三白草酮相當，衍生物C有肝損傷作用。結論 衍生物A的 lgP比三白草酮降低較多， 可能會通過改善體內吸收提高藥效； 衍生物 C的 lgP雖有下降， 但三白草酮中一個次甲二氧基被破壞，顯示出肝損傷作用。

三白草酮； 衍生物； 溶解度； 脂水分配系數(shù)； HPLC； 保肝活性

三白草酮 （ sauchinone） 是從中藥三白草 Sau- rurus chinensis中分離得到的木脂素類化合物［1］， 其含有量高達 0.4%。 研究表明三白草酮具有保肝活性［2-6］， 但藥動學實驗發(fā)現(xiàn)其在 體內的 吸收差， 且消除很快［7］。 初步研究表明三白草酮的水溶性和脂溶性都很差，又因為余凌虹等構建的活性更強的3 個五味子素衍生物都有次甲二氧基和羥基［8］， 可見在具有次甲二氧基的基礎上再引入羥基很可能會增強藥物保肝活性，引入羥基還可能增加水溶性，改善化合物的脂水分配。因此，為了考察三白草酮中羥基及次甲二氧基對活性的影響，本實驗室對三白草酮結構修飾得衍生物 A、 B、 C， 本研究測定三白草酮及衍生物 （圖 1） 的平衡溶解度、 表觀脂水分配系數(shù)，并結合保肝活性，推測化合物結構和溶解性的改變對藥效的影響。

圖1 三白草酮及衍生物 A、 B、 C結構Fig.1 Structures of sauchinone， derivative A， B and C

1 儀器、試藥與動物

Agilent1200 高效液相色譜儀，G1315D型 DAD檢測器， Agilent1200 色 譜 工 作 站； SZ-1 型 快 速 混勻器 （江蘇金壇市全城國勝實驗儀器廠）； Anke TGL-16C高速離心 機 （ 上海 安 亭 科學儀器廠）；Thermomixer Compact恒溫混勻器 （ 德國 Eppendorf公司）； PHS-25 型 pH 計 （ 上 海 雷 磁 儀 器 廠）；AEL-40SM電子分析天平 （ 日本 SHIMADZU公司，精確到 0.01 mg）； 96 孔細胞培養(yǎng)板 （海門 Boyang公司）。

三白草酮及衍生物 A、 B、 C（自制， 純度＞98.0%， 經(jīng)1H-NMR、13C-NMR確定結構， HPLC測定純度）。 谷丙轉氨酶 （ALT） 測定試劑盒 （南京建成生物工程研究所， 批號 20120921）； 谷草轉氨酶 （AST） 測定試劑盒 （南京建成生物工程研究所， 批號 20120920）； 甲醇為色譜純 （江蘇漢邦科技有限公司， 批號 110738）； 水為重蒸水； 其余試劑均為分析純。

昆明種小鼠， 清潔級，初始體質量 18 ～20 g，雄性，上海斯萊克動物有限責任公司提供，合格證號 2007000541228。

2 方法與結果

2.1 平衡溶解度及脂水分配系數(shù)的測定

2.1.1 色譜條件 Agilent HC-C18色譜柱 （4.6 mm ×250 mm， 5 μm）； 流動相甲醇-水 （85 ∶15）； 體積流量 1.0 mL/min； 取各化合物最大吸收波長為檢測波長， 240 nm （三白草酮），300 nm （ A），300 nm （B）， 230 nm （C）；柱溫 25 ℃。三白草酮及衍生物 A、 B、 C的保留時間分別為 6.111、5.268、 7.896、 5.329 min。

2.1.2 標準曲線的制備 精密稱取三白草酮及衍生物 A、 B、 C各 2.00 mg， 置 2 mL量瓶中， 加適量甲醇溶解并稀釋， 配成質量濃度為 1 g/L的貯備液， 采用逐級稀釋法配成 100、 80、 60、 40、 20、10、 5、 1、0.5 mg/L不同質量濃度的標準溶液，分別精密吸取三白草酮及衍生物 A、 B、 C標準溶液20 μL， 注入液相色譜儀， 按 “2.1.1” 項色譜條件測定，記錄峰面積。以各化合物的質量濃度（mg/L） 為橫坐標， 峰面積為縱坐標，得其線性回歸方程分別為 Y=27.84X-8.31 （r2=0.999 7），Y=16.26X-4.19 （r2=0.999 5）， Y=14.57X-1.35 （r2=0.999 5 ）， Y=31.44X+3.95 （ r2= 0.999 4）。 結果表明，三白草酮及各 衍生物在0.5 ～100 mg/L間質量濃度和峰面積呈良好的線性關系。

2.1.3 精密度考察 分別取質量濃度為 20 mg/L的三白草酮及衍生物 A、 B、 C的對照品溶液， 按“2.1.1” 項色譜條件連續(xù)進樣 6 次， 每次 20 μL，記錄峰面積。 結果三白草酮及 A、 B、 C峰面積的RSD分別為 0.91%、 0.72%、 0.97% 和 0.63%，表明儀器的精密度良好。

2.1.4 準確度考察 精密吸取 20 mg/L的三白草酮甲醇溶液 1 mL， 分別加入 16、 20、 24 mg/L的三白草酮對照品溶液 1 mL， 每個質量濃度平行 3份， 搖勻，按 “2.1.1”項色譜條件進樣 20 μL，由標準曲線計算的三白草酮的平均加樣回收率為100.36%， RSD為 1.86%； 同法測 定衍生物 A、B、 C的平均加樣回收率分別為 99.56%、 99.94%和 100.44%， RSD 分 別 為 2.21%、 2.65%和 2.72%。

2.1.5 在常用溶劑和不同 pH緩沖液中平衡溶解度考察 分別取過量的三白草酮及衍生物 A、 B、C， 置 2 mL具塞試管中， 分別加入 1.0 mL水、甲醇、乙醇、正丁醇、正辛醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醚、石油醚，平行3份。超聲溶解10 min （使成飽和溶液） 后， 于 25 ℃下恒溫混勻器中， 300 r/min 振蕩 6 h， 離 心 （ 12 000 r/min，10 min）， 各吸取上清飽和液， 除水溶液經(jīng)適當濃縮后吸取 20 μL， 其余溶液均經(jīng)適當稀釋后吸取10 μL，注入液相色譜儀， 記錄峰面積， 以標準曲線法計算三白草酮及各衍生物在各溶劑中的溶解度，見表1。

表 1 三白草酮及各衍生物在不同溶劑中的平衡溶解度 （n=3）Tab.1 Solubility of sauchinone and its derivatives in different solvents（ n=3）

由表1可見三白草酮及各衍生物在極性較大和較小的溶劑中溶解度較小，而在中等極性溶劑中溶解度較大，在水中溶解度較低， 但A、C在水中的溶解度較三白草酮已有明顯改善，A尤為明顯。

按藥典方法配制 pH為 6.86 的磷酸鹽緩沖液，分別以 0.1 mol/L NaOH和 2%H3PO4調節(jié)一系列pH 為 2.26、 4.00、 5.20、6.86、 7.40、 8.70、11.87 的磷酸鹽緩沖液。分別取適量緩沖液置2 mL具塞試管中，加入過量的三白草酮及各衍生物，平行 3 份， 超聲溶解 10 min （使成飽和溶液）后，于 25 ℃下恒溫混勻器中， 300 r/min 振蕩 6 h， 離心 （12 000 r/min， 10 min）， 各吸取上清飽和液，經(jīng)適當濃縮后吸取20 μL， 注入液相色譜儀， 記錄峰面積。 三白草酮及衍生物 A、 B、 C在不同 pH緩沖液中的溶解度見表2。

表 2 三白草酮及各衍生物在不同 pH的緩沖液中的溶解度（n=3）Tab.2 Solubility of sauchinone and its derivatives in different pH bu ffers（n=3）

由表2可見，三白草酮及各衍生物溶解度隨pH值的增大而略有降低， 推測是由于分子中氧原子在酸性溶液中被質子化而加大了它們的溶解度。

2.1.6 正辛醇 /水系統(tǒng) 中表觀 分配系數(shù)測定 P［9-11］

取三白草酮及各衍生物適量，溶于水飽和的正辛醇中， 使成飽和狀態(tài)， 靜置后離心 （12 000 r/min，10 min）， 精密吸取上清液 0.2 mL置 2 m L具塞試管中， 分別加入正辛醇飽和的水及一系列不同 pH的磷酸鹽緩沖液各 1.5 mL， 平行 3 份。于 25 ℃下恒溫混勻器中， 300 r/min 振蕩 6 h， 靜置 0.5 h，分別吸取正辛醇相和水相，正辛醇相經(jīng)適當稀釋后吸取10 μL，水相經(jīng)適當濃縮后吸取 20 μL， 注入液相色譜儀，記錄峰面積。按照下列公式計算三白草酮及各衍生物的表觀脂水分配系數(shù)。

上式中， P為表觀脂水分配系數(shù)， Cx為分配平衡時藥物在正辛醇相濃度， Cw為分配平衡時藥物在水相中的濃度， Vx為正辛醇相的體積， Vw為水相的體積。 得 25 ℃下三白草酮及衍生物 A、 B、 C在正 辛 醇 /水 中 的 lg P 分 別 為 （ 3.32 ±0.13 ），（2.63 ±0.08）， （3.28 ±0.08）， （2.76 ±0.09）。三白草酮及各衍生物在正辛醇 /緩沖液中的 lg P與pH的關系見圖 2。

由圖 2 可見三白草酮及各衍生物的 lgP隨著水相 pH的升高略有增加。 衍生物 A、 C的脂水分配系數(shù)比三白草酮減小很多，表明衍生物A、C在水相中的分配較三白草酮提高不少。

圖2 三白草酮及各衍生物在不同 pH緩沖液中的表觀分配系數(shù) （n=3）Fig.2 Partition coefficients for the n-octanol-buffer solution system s of sauchinone and its derivatives（ n=3）

2.2 保肝活性研究

2.2.1 四氯化碳肝損傷模型的建立及給藥 取小鼠 120 只， 隨機分為 12 組， 即 正常組、模型組、三白草酮組、衍生物的高、中、低劑量組，每組10只。 適應性飼養(yǎng)3 d后， 除正常組和模型組給予相同體積的 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃外， 三白草酮組給予 50 mg/kg的 三白草酮灌 胃 給藥， 其他三白草酮衍生物 A、 B、 C各組分別給予 10、20、 50 mg/kg灌胃 給 藥， 1 日 1 次 ， 連 續(xù) 7 d。 末次給藥1 h后， 除正常組給予等體積的花生油外，其他各組小鼠腹腔注射 0.1%的四氯化碳花生油10 mL/kg，隨即禁 食 不 禁 水， 間 隔 16 h 后， 眼 眶靜脈取血， 血 樣 于 37 ℃ 水 浴 放 置 30 min 后， 于3 500 r/min離 心 10 min， 分 離 血 清 ， -20 ℃ 保 存待測。

2.2.2 血清 ALT、 AST檢測 按試劑盒操作說明檢測。

2.2.3 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)采用 EXCEL軟件進行統(tǒng)計處理，結果用表示， 組間差異比較采用獨立樣本 t-test分析， 計算 P值。

2.2.4 實驗結果 由表 3 可見， A、 B的 ALT和AST值隨著藥物劑量的增加而降低， 表明兩者對CCl4形成的肝損傷有保護作用， 且保護作用隨著劑量的增大而加強，三白草酮衍生物A的保肝降酶效果比三白草酮好，而三白草酮衍生物B與三白草酮相當。三白草酮衍生物C無保肝降酶作用，反而使 ALT、 AST值升高。

3 討論

本研究采用 HPLC法考察三白草酮及衍生物A、 B、C的平衡溶解度和脂水分配系數(shù)；采用CCl4肝損傷小鼠模型考察它們的保肝活性。 結果表明，三白草酮衍生物A、C較三白草酮在低極性溶劑中的溶解度提高較多，三白草酮衍生物A的提高尤為明顯；藥效學研究表明三白草酮衍生物A的保肝效果較三白草酮有所改善，說明改善化合物的脂水分配確實能提高藥效，三白草酮衍生物C中一個次甲二氧基被破壞，已顯示出肝損傷作用。

表 3 三白草酮及衍生物對血清 ALT和 AST的影響 （n= 10）Tab.3 Effect of sauchinone and its derivatives on the levels of ALT and AST（n=10）

體外測定脂水分配系數(shù)是為了模擬生物體內藥物在水相和生物相之間的分配情況。 正辛醇-水和正辛醇-緩沖液分配系數(shù)在預測藥物吸收上具有重要意義［12］。 Lipinski規(guī)則指出， 如果一個藥物分子具有好的吸收和穿透 特 性， lg P應 小于 5［13-14］， 又有研究表明［15］， lg P介于 0 ～3 的化合物可以口服給藥且在腸道中較易被吸收，三白草酮衍生物A、C的 lg P值均小于 3， B的 lg P值與三白草酮相當，說明羥基的存在能提高水溶性，改善脂水分配。藥效學研究表明A的降酶效果比三白草酮提高不少，這可能是A的脂水分配改善后體內的吸收得到提高，所以提高了藥效。但C已顯示出肝損傷作用，有文獻報道［8］次甲二氧基為保肝活性基團， 可見在結構修飾改善水溶性時不能破壞次甲二氧基。

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Solubility and hepatoprotective effect of sauchinone and its derivatives

XU Chun-lei1， XUE Ping2， WU Yu-lan1， ZHANG Fang1， LIXiang1*
（1.College of Pharmacy， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China； 2.Changzhou Institute for Drug Control， Changzhou 213003， China）

sauchinone； derivative； solubility； oil/water partition coefficient； HPLC； hepatoprotective effect

R284.1

： A

： 1001-1528（2014）05-0960-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.017

2013-08-14

國家自然科學基金青年項目 （81102899）； 江蘇省高校自然科學研究項目 （12KJB360006）； 南京中醫(yī)藥大學校青年自然科學基金項目 （11XZR11）

徐春蕾 （1978—） ， 女， 講師， 博士， 研究方向： 天然藥物化學。 Tel： 13915967347， E-mail： xcl127@163.com

*通信作者： 李 祥 （1953—） ， 女， 教授， 博士， 研究方向： 天然藥物化學。 Tel： 13913925677， E-mail： lixiang_8182@163.com