吳 娜， 劉星雨， 王篤軍， 羅 盼， 吳 瑤， 魏 淵

（江蘇大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

雷公藤內(nèi)酯醇對(duì) C57BL/6 小鼠亞慢性毒性作用的研究

吳 娜， 劉星雨， 王篤軍， 羅 盼， 吳 瑤， 魏 淵*

（江蘇大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

目的 探討長(zhǎng)期應(yīng)用雷公藤內(nèi)酯醇對(duì) C57BL/6 小鼠全身主要組織功能的毒性和生化指標(biāo)的影響。 方法 8 周齡C57BL/6 小鼠 30 只， 隨機(jī)分為 3 組。 分別腹腔注射雷公藤內(nèi)酯醇連續(xù) 30 d。 觀察小鼠體質(zhì)量變化。 采用 ELISA法檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和尿素氮水平并檢測(cè)肝組織勻漿中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶，還原型谷胱甘肽和腎組織勻漿中還原型谷胱甘肽水平； 求臟器指數(shù)； 病理組織切片 H&E染色法觀察 C57BL/6 小鼠肝臟、 腎、 胃、 肺、 睪丸、 脾、 十二指腸等組織。 結(jié)果 與正常對(duì)照組比較， 雷公藤內(nèi)酯醇組小鼠28 d 時(shí)體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯降低； 雷公藤內(nèi)酯醇高劑量組血清中的尿素氮有較顯著上升，肝組織和腎組織中的還原型谷胱甘肽水平都出現(xiàn)降低并有顯著性差異；雷公藤內(nèi)酯醇組小鼠睪丸臟器指數(shù)都降低，而高劑量組小鼠脾臟臟器指數(shù)出現(xiàn)上升，其他臟器指數(shù)無(wú)顯著性差異；觀察病理組織切片發(fā)現(xiàn) C57BL/6 小鼠低劑量組與高劑量組小鼠腎、 脾臟、 睪丸均有明顯損傷， 高劑量組損傷更嚴(yán)重。結(jié)論 長(zhǎng)期應(yīng)用雷公藤內(nèi)酯醇對(duì) C57BL/6 小鼠全身主要組織功能有一定的影響， 尤其對(duì)小鼠腎、 脾臟和睪丸功能有較強(qiáng)的毒性作用。

雷公藤內(nèi)酯醇； C57BL/6 小鼠； 亞慢性毒性

雷公藤 Tripterygium wilfordii Hook.f.為衛(wèi)矛科一年生藤本植物，廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江以南各省區(qū)及西南各地。雷公藤作為中醫(yī)臨床常用藥物，應(yīng)用十分廣泛。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)雷公藤對(duì)器官移植的排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病、腎病綜合征、癌癥等方面療效顯 著［1-2］。 雷 公 藤 內(nèi)酯 醇 （ triptolide） 是從雷公藤中分離出的活性最高的環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物，是雷公藤的主要有效成分之一，其相關(guān)效價(jià)比雷公藤總苷高 100 ～200 倍［3］。 藥理和臨床試驗(yàn)表明 其 具 有 抗 腫 瘤、 免 疫 抑 制、 抗 炎［4］及 抗 生育［5］等生物活性。此外， 耶魯大學(xué) Crews研究組于2007 年在 《美國(guó)科學(xué)院院刊 （PNAS）》 上報(bào)道了雷公藤內(nèi)酯醇能明顯減少小鼠多囊腎 （PKD） 胞囊的形成［6］， 為治療這一導(dǎo)致腎衰竭的重要疾病提供了新的思路。 明尼蘇達(dá)大學(xué) Antonoff等在 2009年報(bào)道雷公藤內(nèi)酯醇可降低胰腺癌細(xì)胞中的 HSP70水平，進(jìn)而減少小鼠體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，可以有效治療胰腺癌［7］。

隨著雷公藤內(nèi)酯醇臨床應(yīng)用的推廣，它的毒副作用也引起人們普遍關(guān)注，其不良反應(yīng)主要發(fā)生在消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、骨髓及血液系統(tǒng)，此外還可引起水腫、血糖升高、復(fù)視等［8］。 小鼠動(dòng)物模型是研究雷公藤內(nèi)酯醇體內(nèi)毒性的良好工具， 劉良等［9］采用昆明種小鼠進(jìn)行亞慢性中毒實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期應(yīng)用雷公藤內(nèi)酯醇能引起小鼠腎損傷及睪丸萎縮。然而雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)小鼠其他重要組織器官的亞慢性毒性作用影響目前仍不十分明確，因此急需對(duì)此進(jìn)行更系統(tǒng)的研究。昆明種小鼠是我國(guó)生產(chǎn)量、使用量最大的遠(yuǎn)交群小鼠，被廣泛應(yīng)用于藥理學(xué)、毒理學(xué)等領(lǐng)域的研究，但存在基因雜合率高， 遺傳背景復(fù)雜的問 題［10］，在毒理學(xué)研究方面存在一定的局限性，這就為后續(xù)的研究帶來(lái)了障礙。為解決這一問題，本實(shí)驗(yàn)選用C57BL/6 小鼠這一標(biāo)準(zhǔn)近交品系， 對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇亞慢性毒性作用進(jìn)行了初步的研究，以期得到精度更高，可比性更好，應(yīng)激反應(yīng)更為均一的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為更深入地研究雷公藤內(nèi)酯醇的臨床毒性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 雷公藤內(nèi)酯醇 （純度大于 99%）購(gòu)買于 Chroma Dex。 谷丙轉(zhuǎn)氨酶 （alanine transaminase， ALT） 、 谷草轉(zhuǎn)氨酶 （ aspartate transaminase，AST）、尿素氮 （blood urea nitrogen，BUN） 和還原型谷胱甘肽 （ glutathione，GSH） ELISA檢 測(cè)試劑盒均購(gòu)買于南京建成生物工程研究所。 BCA蛋白濃度試劑盒購(gòu)買于碧云天生物技術(shù)研究所。其余為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)的分析純或生化級(jí)試劑。

1.2 藥品的配制 精密稱取雷公藤內(nèi)酯醇充分溶解于吐溫 80， 再以氯化鈉注射液稀釋至所需劑量，吐溫 80 在終溶液中比例不超過 1% （V/V）， 4 ℃冰箱保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的 C57BL/6 小鼠， 均購(gòu)買于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，合格證號(hào)：SCXK （蘇） 2010-0001， 體質(zhì)量 18 ～22 g（20 ± 2 g）， 雄性， 8 周大小。 購(gòu)買后在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后用于正式實(shí)驗(yàn)， 室溫 22 ～25 ℃， 相對(duì)濕度 65%， 12 h 明暗交替照明， 自由進(jìn)食、 飲水。

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物完全隨機(jī)分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組10只， 分別設(shè)為正常對(duì)照組， 低劑量組和高劑量組。 給藥期限為 30 d， 給藥方式為每 48 h 腹腔注射 1 次， 雷公藤內(nèi)酯醇小鼠腹腔注射的 LD50為0.86 mg/kg［11］， 本實(shí)驗(yàn)采用正常臨床給藥劑量依次設(shè)為： 正常對(duì)照組， 用氯化鈉注射液與吐溫80按同樣比例混和作溶劑對(duì)照，按體質(zhì)量給予相當(dāng)量的溶劑對(duì)照液； 低劑量組， 按 100 μg/kg腹腔注射雷公藤內(nèi)酯醇溶液； 高劑量組， 按 200 μg/kg腹腔注射雷公藤內(nèi)酯醇溶液。每次給藥前稱定質(zhì)量，末次給藥后， 隔天禁食12 h， 用二氧化碳窒息法處死小鼠。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 小鼠體質(zhì)量變化觀察 分別于給藥前、 給藥 7、 14、 21、 28 d 時(shí)稱量動(dòng)物體質(zhì)量， 稱體質(zhì)量前動(dòng)物均禁食 12 h。

1.4.2 血清生化指標(biāo)的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后， 將 3組小鼠以二氧化碳窒息法處死。心臟取血，室溫血液自 然 凝 固 2 h， 離 心 20 min （ 3 000 r/min）收集上清， 放于 -80 ℃保存直至分析。 測(cè)定血清ALT、 AST及 BUN， 分別用于了解肝功能及腎功能。

1.4.3 組織中的生化指標(biāo)的測(cè)定 處死后的小鼠， 取其各臟器稱定質(zhì)量后， 將肝臟 （3/4） 腎（1/2） 凍于 -80 ℃冰箱中待用。 準(zhǔn)確稱取肝組織的質(zhì)量，按質(zhì)量體積比加9倍的生理鹽水制成10%的勻漿，3 500 r/min離心 10 min， 取上清待測(cè)。 測(cè)定肝組織中的 ALT、 AST及 GSH值進(jìn)一步了解肝功能。

1.4.4 臟器指數(shù)的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后， 稱取所有動(dòng)物的體質(zhì)量，并將心臟、肝臟、脾臟、肺、腎及雙側(cè)睪丸稱定質(zhì)量，求臟器指數(shù)。觀察藥物對(duì)各臟器的影響，進(jìn)行初步的毒性判斷。

1.4.5 病理組織切片觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后， 將各組織器官剔除脂肪組織及筋膜后稱定質(zhì)量，取肝臟、腎、胃、肺、睪丸、脾、十二指腸等器官，隨即放入裝有10%中性福爾馬林固定液的標(biāo)本瓶中浸泡固定， 48 h后作病理組織學(xué)檢查， 常規(guī)取材， 脫水， 石蠟包埋， 制片 （5 μm厚）， H&E染色， 光鏡觀察各個(gè)器官組織形態(tài)學(xué)變化及黏膜、黏膜下間質(zhì)形態(tài)學(xué)的改變。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤內(nèi)酯醇給藥組 C57BL/6 小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)變緩 雷公藤內(nèi)酯醇腹腔注射 C57BL/6 小鼠 7 d時(shí)所有動(dòng)物體質(zhì)量均較給藥前上升，增加的幅度與正常對(duì)照組基本接近或稍低。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到 14 d時(shí)各組動(dòng)物體質(zhì)量出現(xiàn)了明顯不同的變化。低劑量組及高劑量組小鼠體質(zhì)量仍表現(xiàn)為一定程度的增加，但增加的幅度較正常對(duì)照組有較大程度的減緩。而實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到21 d時(shí)， 高劑量組所有小鼠體質(zhì)量與溶劑對(duì)照組小鼠相比，體質(zhì)量增長(zhǎng)幅度明顯下降，平均體質(zhì)量降至接近給藥前。 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行到28 d時(shí)，低劑量組和高劑量組小鼠所有體質(zhì)量增長(zhǎng)幅度與溶劑對(duì)照組相比均明顯下降，個(gè)別小鼠體質(zhì)量甚至降至低于給藥前的水平， 結(jié)果見圖1。除體質(zhì)量的變化外，給藥后的小鼠外觀未觀察到明顯的毒性表現(xiàn)。

2.2 雷公藤內(nèi)酯醇給藥對(duì) C57BL/6 小鼠血清中生化指標(biāo)的影響 雷公藤內(nèi)酯醇給藥對(duì) C57BL/6 小鼠血清肝功能指標(biāo) ALT， AST和腎臟功能指標(biāo)BUN的影響見表1。 低劑量組及高劑量組與正常對(duì)照組相比， 血清中的 ALT、AST值沒有顯著性差異； 而高劑量組血清中的 BUN有較顯著上升， 增長(zhǎng) 34.5% （P＜0.05）， 說(shuō)明高劑量雷公藤內(nèi)酯醇給藥30 d后已明顯導(dǎo)致小鼠腎小球尿素氮濾過率降低，功能受損。

圖 1 雷公藤內(nèi)酯醇給藥后對(duì) C57B/6 小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)的影響 （n=10，）Fig.1 Effects of consecu tive adm inistration of triptolide on gained body weights in the C57BL/6 m ice（ n=10，）

表 1 雷公藤內(nèi)酯醇給藥對(duì) C57BL/6 小鼠血清 ALT， AST及 BUN水平的影響 （n=10，）Tab.1 Effects of triptolide-treatments on serum biochem ical parameters in the C57/BL6m ice（n=10，）

表 1 雷公藤內(nèi)酯醇給藥對(duì) C57BL/6 小鼠血清 ALT， AST及 BUN水平的影響 （n=10，）Tab.1 Effects of triptolide-treatments on serum biochem ical parameters in the C57/BL6m ice（n=10，）

注： 與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05

組 別 ALT/（U·L-1）AST/（U·L-1）BUN/（ mmol·L-1）27.11 ±2.25 55.1 ±2.2 8.7 ±1.2雷公藤內(nèi)酯醇低劑量組 29.71 ±2.43 62.7 ±4.4 9.0 ±1.1雷公藤內(nèi)酯醇高劑量組 30.54 ±2.16 71.2 ±5.8 11.7 ±1.9正常對(duì)照組*

2.3 雷公藤內(nèi)酯醇給藥對(duì) C57BL/6 小鼠肝和腎組織中生化指標(biāo)的影響 雷公藤內(nèi)酯醇給藥對(duì)C57BL/6 小鼠組織勻漿中生化指標(biāo) ALT， AST和GSH的影響見表 2。 低劑量組及高劑量組與正常對(duì)照組相比， 肝組織中的 ALT、 AST值沒有顯著性差異； 而高劑量組肝組織和腎組織中的 GSH水平分別降低了 27.0%和 15.80%，P＜0.05 有顯著性差異。

表 2 雷公藤內(nèi)酯醇給藥對(duì) C57BL/6 小鼠肝組織中 ALT， AST及 GSH和腎組織中 GSH水平的影響 （n=10，）Tab.2 E ffects of triptolide-treatments on liver or kidney homogenates in the C57/BL6 m ice（ n=10，）

表 2 雷公藤內(nèi)酯醇給藥對(duì) C57BL/6 小鼠肝組織中 ALT， AST及 GSH和腎組織中 GSH水平的影響 （n=10，）Tab.2 E ffects of triptolide-treatments on liver or kidney homogenates in the C57/BL6 m ice（ n=10，）

注： 與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05

組 別 肝 ALT/（ U·gprot-1） 肝 AST/（ U·gprot-1） 肝 GSH/（ μmol·g prot-1） 腎 GSH/（ μmol·g prot-1）72.5 ±4.0 72.1 ±5.4 11.4 ±3.8 12.2 ±0.7雷公藤內(nèi)酯醇低劑量組 64.6 ±5.4 61.7 ±6.3 9.7 ±2.8 11.0 ±1.4雷公藤內(nèi)酯醇高劑量組 60.1 ±3.2 59.6 ±4.5 8.3 ±1.5* 10.3 ±1.2正常對(duì)照組*

2.4 臟器指數(shù)的比較 雷公藤內(nèi)酯醇亞慢性中毒對(duì) C57BL/6 小鼠各臟器指數(shù)的影響， 見表 3。 低劑量組及高劑量組與正常對(duì)照組相比，小鼠的心、肝、腎臟、肺臟器指數(shù)沒有顯著性差異；低劑量組及高劑量組與溶劑組相比睪丸臟器指數(shù)顯著降低（P＜0.01）； 高劑量組脾臟器指數(shù)顯著增大 （P＜0.05）。

表 3 雷公藤內(nèi)酯醇給藥對(duì) C57BL/6 小鼠各臟器指數(shù)的影響Tab.3 Viscera index of the C57/BL6 m ice adm inistered w ith triptolide by intraperitoneal injection for 30 days

2.5 病理組織切片觀察 在光學(xué)顯微鏡下觀察各組織病理切片，發(fā)現(xiàn)雷公藤內(nèi)酯醇給藥的小鼠的腎臟、脾臟和睪丸組織發(fā)生較明顯的病理變化。低劑量組小鼠腎組織中大量炎癥細(xì)胞聚集，高劑量組小鼠腎組織被大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小球病變毛細(xì)血管袢界限不清晰 （見圖 2）。 低劑量組與高劑量組小鼠脾臟脾髓中紅髓區(qū)域增多，脾竇充血，脾細(xì)胞間隙增大 （見圖 3）。 對(duì)照組小鼠睪丸中生精小管中含有大量生殖細(xì)胞，小管中央可見小的、深染的橢圓形精子；低劑量組小鼠睪丸中顯示局灶性生精小管萎縮，睪丸間質(zhì)細(xì)胞受損，殘存部分具有正常生精活性的生精小管；高劑量組小鼠睪丸中生精小管大量萎縮，少見具有正常形態(tài)的精細(xì)胞 （見圖4）。 本次實(shí)驗(yàn)小鼠病理組織切片雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)小鼠的肝、肺、胃和十二指腸損傷不明顯。

圖 2 雷公藤內(nèi)酯醇給藥后各組小鼠腎臟組織病理學(xué)檢查 （ ×100）Fig.2 M icrograph of kidney from a C57/BL6 rat treated with vehicle（ ×100）

圖 3 雷公藤內(nèi)酯醇給藥后各組小鼠脾臟組織病理學(xué)檢查 （ ×100）Fig.3 M icrograph of spleen from a C57/BL6 rat treated with vehicle（ ×100）

3 討論

雷公藤內(nèi)酯醇是中藥雷公藤的主要生物活性成分，具有包括抗炎、抗腫瘤、抗生育在內(nèi)的多重生物學(xué)作用，特別值得注意的是近年報(bào)道雷公藤內(nèi)酯醇對(duì) PKD和胰腺癌細(xì)胞抑制作用［6-7］， 是學(xué)界最關(guān)注的天然活性產(chǎn)物之一。但由于雷公藤內(nèi)酯醇具有較強(qiáng)的毒性，嚴(yán)重影響了其開發(fā)利用，如何保持其生物活性并降低其不良反應(yīng)是亟待解決的問題。本實(shí)驗(yàn)采用 “標(biāo)準(zhǔn)” 的近交系 C57BL/6 小鼠研究雷公藤內(nèi)酯醇亞慢性中毒對(duì)其全身主要組織功能的影響，實(shí)驗(yàn)精度高，均一性和可重復(fù)性較好。

圖 4 雷公藤內(nèi)酯醇給藥后各組小鼠睪丸組織病理學(xué)檢查 （ ×100）Fig.4 M icrograph of testis from a C57/BL6 rat treated with vehicle（ ×100）

在本實(shí)驗(yàn)中較低劑量 （100 μg/kg） 下， 雷公藤內(nèi)酯醇對(duì) C57BL/6 小鼠的腎臟、 脾臟、睪丸有明顯損傷，對(duì)肝、肺、胃及十二指腸均未見明顯影響； 在較高劑量 （200 μg/kg）下對(duì) C57BL/6 小鼠腎臟、脾臟、睪丸損傷加重，對(duì)肝、肺、胃及十二指腸仍未見明顯影響。 與劉良等報(bào)道［9］相比， 本實(shí)驗(yàn)在給藥過程中并未出現(xiàn)死亡，該品系小鼠用于亞慢性中毒實(shí)驗(yàn)個(gè)體差異較小，均一性好，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)更加精確。并且發(fā)現(xiàn)雷公藤內(nèi)酯醇亞慢性中毒除了對(duì)小鼠睪丸和腎臟有明顯損傷外，還導(dǎo)致小鼠脾臟腫大，該區(qū)別是否由于小鼠品系差異導(dǎo)致，還有待于進(jìn)一步確認(rèn)。

本實(shí)驗(yàn)除測(cè)定 ALT、 AST和 BUN等常規(guī)生化指標(biāo)外， 還測(cè)定了肝、腎組織勻漿中 GSH水平。與正常對(duì)照組相比，雷公藤內(nèi)酯醇高劑量組小鼠腎組織勻漿和肝組織勻漿中 GSH水平下降。 GSH是細(xì)胞內(nèi)的氧自由基最主要的清除劑，正常情況下，組織中總谷胱甘肽水平是相對(duì)恒定的， GSH水平主要因?yàn)榍宄?xì)胞內(nèi)氧自由基而下降。楊凌教授等研究組［12-14］分別報(bào)道 了肝藥 酶 CYP3A是肝 臟中雷公藤內(nèi)酯醇的主要解毒酶，可推測(cè)其解毒過程中產(chǎn)生的氧自由基是肝臟 GSH消耗的主要原因。 而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠腎臟中 GSH同樣顯著降低， 腎臟中的細(xì)胞色素 P450 酶系是否同樣可以起到解毒作用并導(dǎo)致 GSH消耗， 是本課題組繼續(xù)研究的方向。

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Sub-chronic toxicities of triptolide to C57BL/6 m ice

WU Na， LIU Xing-yu， WANG Du-jun， LUO Pan， WU Yao， WEIYuan*
（School of Pharmacy， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China ）

AIM To investigate the sub-chronic effects of triptolide（ TP） to the major organs of C57BL/6 mice.METHODS Thirty C57BL/6micewere evenly divided into three groups（n=10） ， and treated with TP for 30 days.Their body weights were measured.The levels of alanine transaminase（ ALT） ， aspartate transaminase（ AST） ， blood urea nitrogen （ BUN） in serum， and the levels of ALT， AST， and glutathione（ GSH） in liver and kidney homogenatesweremeasured by ELISA.Weights ofmice’smajor organsweremeasured to calculate the viscera index.The histopathological changesof liver， kidney， spleen， lung，stomach， testis，and intestine in C57BL/ 6 micewere investigated by H&E staining.RESULTS Compared with the control group， the gained body weights of the TP group on the 28th day significantly decreased （P＜0.05）.The serum BUN levels in high dose TP group significantly increased.The GSH level in liver homogenates and kidney homogenates of the 200 μg/kg TP group significantly decreased.In addition，the testis indexes of both low and high dose groups significantly decreased，while the spleen index of the 200 μg/kg TP group significantly increased.CONCLUSION TP has sub-chronic intoxication on major organs of C57BL/6 mice， especially kidney， spleen and testis.

triptolide；C57BL/6 mice； sub-chronic intoxication

R966

： A

： 1001-1528（2014）05-0904-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.004

2013-04-20

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目 （81102522）； 江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （BK2011473）； 江蘇省博士后科研資助計(jì)劃（1201081C）

吳 娜 （1989—）， 女， 碩士生， 主要從事中藥毒理學(xué)研究。

*通信作者： 魏 淵 （1981—） ， 男， 副教授， 主要從事中 藥的藥 物代謝和毒 理學(xué)研究。 Tel： （ 0511） 88791526， E-mail： ywei@ujs. edu.cn