亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        疏肝健脾方藥對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠 Kup ffer細(xì)胞 SREBP-1c信號(hào)通路相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響

        2014-04-11 12:01:10楊欽河張玉佩徐擁建劉益臻楊雪松
        中成藥 2014年5期
        關(guān)鍵詞:合方方藥疏肝

        韓 莉, 楊欽河, 張玉佩, 徐擁建, 劉益臻, 楊雪松, 金 玲

        (1.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院, 廣東 廣州 510632; 2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系, 廣東 廣州 510632; 3.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室, 廣東 廣州 510632)

        [藥 理]

        疏肝健脾方藥對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠 Kup ffer細(xì)胞 SREBP-1c信號(hào)通路相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響

        韓 莉1, 楊欽河2*, 張玉佩2, 徐擁建2, 劉益臻2, 楊雪松3, 金 玲1

        (1.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院, 廣東 廣州 510632; 2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系, 廣東 廣州 510632; 3.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室, 廣東 廣州 510632)

        目的 觀 察 疏 肝 健 脾 方 藥 對(duì) 非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 病 ( NAFLD) 大 鼠 Kupffer細(xì) 胞 固 醇 調(diào) 節(jié) 元 件 結(jié) 合 蛋 白-1c(SREBP-1c) 信號(hào)通路相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響及可能的機(jī)制。 方法 采用高脂飼料喂養(yǎng)復(fù)制大鼠 NAFLD模型,各藥物干預(yù)組灌飼相應(yīng)的疏肝健脾方藥,8周后檢測(cè)血液常規(guī)生化指標(biāo),觀察肝組織病理形態(tài)改變;采用離體循環(huán)灌注Ⅳ型膠原酶法提取肝 臟 Kupffer細(xì)胞, Q-PCR及 Western blot法檢 測(cè) Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c、 硬 脂酰輔酶 A去飽合酶-1 ( SCD-1) mRNA及蛋白 表 達(dá) 水 平。 結(jié) 果 模 型 組 大 鼠 肝 臟 脂 肪 蓄 積; 血 脂 及 Kupffer細(xì) 胞 SREBP-1c、 SCD-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平較正常組均顯著升高 ( P<0.01 ) ; 各藥物干預(yù)組 Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c、 SCD-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均有不同程度的下調(diào),同時(shí)血脂及病理學(xué)改變也較模型組有不同程度的改善, 以疏肝組作用最為顯著 (P<0.01) 。 結(jié)論 疏肝健脾方藥可能是通過(guò)抑制 Kup ffer細(xì)胞 SREBP-1c/SCD-1 信號(hào)通路激活, 下調(diào)血清總膽固醇、 甘油三酯合成, 減少肝臟脂質(zhì)沉積, 發(fā)揮抗 NAFLD作用。 可推測(cè) SREBP-1c、 SCD-1 mRNA及蛋白可能是疏肝健脾方藥抗NAFLD的有效作用靶點(diǎn)。

        疏肝健脾方藥; 非酒精性脂肪性肝病; 固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c; 硬脂酰輔酶 A去飽和酶-1; Kup ffer細(xì)胞;大鼠

        非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 病 ( nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD) 是一種與遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)且無(wú)過(guò)量飲酒史、肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)貯積為特征的臨床病理綜合征,包括單純性脂肪肝、非酒精 性 脂 肪 性 肝 炎 ( nonalcoholic steatohepatitis,NASH) 及 NASH相關(guān)肝纖維化、 肝硬化。 其發(fā)病非單一因素引起,可能與脂質(zhì)代謝障礙、胰島素抵抗、線粒體功能障礙、2型糖尿病、高血壓和其他一些代謝癥候群等密切相關(guān)[1-3]。 固醇調(diào)節(jié) 元件結(jié)合蛋白-1c( sterol regulatory element binding proteins-1c, SREBP-1c) 和 硬 脂 酰 輔 酶 A 去 飽 和 酶-1(stearyl-CoA desaturase-1, SCD-1 ) 是 參 與脂 肪 酸合成代謝過(guò)程的重要調(diào)控因子。 研究表明, NAFLD時(shí)肝臟 SREBP-1c可激活下游多種參與脂肪酸和甘油三酯合成酶的轉(zhuǎn)錄, 包括 SCD-1、 脂肪酸合成酶、乙酰輔酶A羧化酶等,導(dǎo)致脂肪酸合成增加,造成肝臟脂質(zhì)蓄 積[4]。 本 課 題組前期研 究 發(fā) 現(xiàn),疏肝健脾方藥可顯著改善 NAFLD大鼠肝臟脂質(zhì)代謝紊亂, 減輕肝臟脂肪變性, 防治 NAFLD作用療效確切[5-7]。 本 實(shí) 驗(yàn) 觀 察 疏 肝 健 脾 方 藥 對(duì) NAFLD大鼠肝臟 Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c/SCD-1 信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響, 探討其抗 NAFLD的干預(yù)作用機(jī)制。

        1 材料

        1.1 動(dòng)物 雄性 SD大鼠, SPF級(jí), 6 周齡, 體質(zhì)量 (200 ±20) g, 廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào): SCXK (粵) 2008-0020, 合格批號(hào) 0107792。

        1.2 主要儀器與試劑 AU600 全自動(dòng)生化分析儀(日本 Olympus公司) ; ELITE流式細(xì) 胞儀 ( 美國(guó)BECKMAN-COULTER公司); KDS200 雙通道注射泵 (美國(guó) KD Scientific公司); CFX Manager實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀 (美國(guó) BIO-RAD公司)。 Trizol裂解液 (批號(hào) D9108A)、 Quant cDNA第一鏈合成試劑盒 ( 批 號(hào) DRR047A)、 SYBR Green 熒光 定 量PCR試劑盒 (批號(hào) DRR820A)均購(gòu)自日本 Takara公 司; SREBP-1c Antibody( 批 號(hào) GR111569-1 )、SCD-1 Antibody( 批 號(hào) GR91951-1 ) 均 購(gòu) 自 美 國(guó)Abcam公司; 兔抗大鼠 Anti-Lysozyme(批號(hào) Y-Bo-07J26C)購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司; Ⅳ型膠原酶 ( 批號(hào) C8160-100) 購(gòu)自美國(guó) GBICO公司; Nycodenz細(xì)胞分離液 (批號(hào) 1002424-1) 購(gòu)自瑞典 Axis-shield 公司。

        1.3 實(shí)驗(yàn)藥材 方藥組成及飲片劑量均參照 《方劑學(xué)》 教 材[8]。 疏 肝 方 藥 ( 柴 胡 疏 肝 散: 柴 胡6 g, 川芎5 g, 枳殼 5 g, 陳皮 6 g, 白芍5 g, 香附5 g,炙甘草 3 g)、健脾方藥 (參苓白術(shù)散:人參15 g, 白術(shù) 15 g, 茯苓 15 g,薏苡仁9 g, 砂仁 6 g,山藥 15 g, 桔梗 6 g, 白扁豆 12 g, 蓮子 9 g, 炙甘草 9 g)、 合方 (柴胡疏肝散與參苓白術(shù)散合用方)中藥材均為深圳華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)的免煎單味中藥配方顆粒,購(gòu)自暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房。免煎中藥配方顆粒按包裝說(shuō)明換算成實(shí)驗(yàn)所需的飲片劑量,溶于水制成水溶劑。其中疏肝方 含 生 藥 量 0.96 g/mL; 健 脾 方 含 生 藥 量3.00 g/mL; 合方含生藥量 3.96 g/mL。

        2 方法

        2.1 動(dòng)物分組及處理 將大鼠隨機(jī)分為正常組、 模型組、 疏肝組、健脾組、合方組, 每組 15 只。NAFLD大鼠模型建立在本課題組以往的造模方法[9]的基礎(chǔ)上加以改進(jìn), 建立 NAFLD大鼠模型。 除正常組大鼠給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)外,其余各組大鼠均以高脂飼料 (基礎(chǔ)飼料 88%,豬油10%, 膽固醇 1.5%,3 號(hào) 膽 鹽 0.5%) 喂 養(yǎng) 造 模。 同 時(shí) 各 組 按10 mL/(kg體質(zhì)量)給予相應(yīng)的藥物或蒸餾水灌胃。本課題組前期[10]已探討不同疏肝健脾方藥劑量對(duì)NAFLD大鼠的干預(yù)作用, 表明人臨床等效劑量的3倍用量在改善 NAFLD大鼠肝功能,降低血脂、肝脂,減輕肝臟脂肪變性療效更為顯著。因此本實(shí)驗(yàn)采用成人臨床等效劑量的3倍用量,疏肝組為9.6 g/(kg·d),健脾組為 30 g/(kg·d),合方組為39.6 g/(kg·d)。 每日上午 8 ∶00 灌胃 1 次,1周稱體質(zhì)量1次,根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量,連續(xù)8 周。 各組動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于 22 ~26 ℃, 明暗各12 h的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi), 自由飲水進(jìn)食。 實(shí)驗(yàn)期間觀察大鼠毛色、體態(tài)、食欲、行為狀態(tài)、大小便及對(duì)外界刺激的反應(yīng)。

        2.2 標(biāo)本采集 第 8 周后, 禁食 12 h, 每組 8 ~9只大鼠 (注:因灌胃不當(dāng),正常組、模型組、健脾組及合方組大鼠各死亡1只)以 3%戊巴比妥鈉按 0.1 mL/(kg體質(zhì)量)腹腔麻醉, 腹主動(dòng)脈采血,距離肝邊緣 0.5 cm處取相同部位肝右葉組織若干,-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?其余 6 只用以分離Kupffer細(xì)胞。

        2.3 肝組織觀察 距離肝邊緣 0.5 cm處取相同部位肝右葉小塊約 1.5 cm×1 cm×0.5 cm, 冰凍切片作油紅O染色觀察肝細(xì)胞內(nèi)脂滴的分布情況。另若干小塊以 10%中性甲醛溶液固定, 常規(guī)石蠟包埋, 作4μm連續(xù)切片行 HE染色, 光鏡下觀察大鼠肝臟脂肪變性情況。需要注意的是脂滴極易降解,因此取肝組織后應(yīng)當(dāng)日即行油紅O染色。

        2.4 血脂檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清血清總膽固醇 (TC)、 甘油三酯 (TG)、 高密度脂蛋白 膽 固 醇 ( HDL-C)、 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇(LDL-C)水平。

        2.5 Kupffer細(xì)胞分離及鑒定 采用離體循環(huán)灌注Ⅳ 型 膠 原 酶 法 提 取 Kupffer細(xì) 胞, 流 式 細(xì) 胞 術(shù)(flow cytometry, FCM) 鑒定細(xì)胞純度, 具體分離與鑒定 方 法 詳見(jiàn)本課 題 組 已 發(fā) 表 論 文[11], 不 再贅述。

        2.6 Q-PCR法檢測(cè) Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c、 SCD-1 mRNA表達(dá)水平 采用 Trizol裂解肝細(xì)胞, 提取總RNA,分光光度計(jì)檢測(cè)總 RNA水平,然后逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。 引物設(shè)計(jì)依據(jù) Genebank 采用 Primer 5.0軟件以 GAPDH基因序列為內(nèi)參照物, 由上海捷瑞生物工程有限公司合成, 引物序列見(jiàn)表 1。 PCR擴(kuò)增采用25 μL反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為90 ℃預(yù)變性,持 續(xù) 30 min; 95 ℃ 變 性, 持 續(xù) 5 s; GAPDH、 SREBP-1c、 SCD-1 均為 58 ℃, 退火 20 s; 60 ℃延伸, 持續(xù) 45 s, 39 個(gè)循環(huán); 溶解曲線分析, 65 ~95 ℃, 持續(xù) 5 ~10 s。 反應(yīng)完畢, 用 Opticon Monitor 3.1 軟件處理結(jié)果, 設(shè)定正常組基因表達(dá)水平為 1。 公式 2-ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組目的基因表達(dá)相對(duì)于正常組 的 變 化 倍 數(shù)。 ΔΔCt=實(shí) 驗(yàn) 組 ( Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因) -空白組 (Ct目的基因-Ct內(nèi)參其因)。

        表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

        2.7 Western blot法檢測(cè) Kupffer細(xì) 胞 SREBP-1c、SCD-1 蛋白表達(dá)水平 每 5 ×106個(gè)細(xì)胞加入 1 mL RIPA裂 解 液 (含 PMSF) , 吹 打 混 勻 后,4 ℃,14 000 r/min,離心 8 min,取 上 清 BCA法 測(cè) 定 總蛋白濃度, 調(diào)整樣品上樣量終質(zhì)量濃度為 50~80 μg/μL。 注意為避免蛋白降解, 全程都應(yīng)在冰臺(tái)上操作。 經(jīng) SDS-PAGE電泳分離蛋白, 然后轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上, 加 5%脫脂奶粉封閉液, 室溫下平搖1 h; 洗膜, 加一抗稀釋液4℃過(guò)夜孵育; 洗膜, 加二抗稀釋液室溫孵育1 h, 洗膜后, 進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。 用 Quantity One軟件分析內(nèi)參與目的蛋白的光密度值,統(tǒng)計(jì)分析。

        2.8 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 處 理 計(jì) 量 資 料 以 均 數(shù) ±標(biāo) 準(zhǔn) 差() 表 示, 采 用 SPSS 19.0 進(jìn) 行 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 處 理,組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,方差齊時(shí)用SNK ( Student-Newman-Keuls, 即 q檢 驗(yàn) ) 法 進(jìn) 行組間兩兩比較, 方差不齊時(shí)用 Tamhane’s T2 檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn) P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        3 結(jié)果

        3.1 動(dòng)物一般狀況 正常組大鼠毛色光澤,飲食、排泄物較正常,性情溫順,對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏。模型組大鼠體毛略黃而干枯,體型肥胖,大便油膩感質(zhì)略稀,對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍,容易激惹。各用藥組大鼠一般情況介于正常組和模型組大鼠之間。

        3.2 肝組織病理學(xué)觀察

        3.2.1 油紅 O染色結(jié)果 正常組大鼠肝細(xì)胞核呈淡藍(lán)染色,少許肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)散在的紅染脂滴。模型組大鼠肝細(xì)胞腫脹,細(xì)胞核呈深藍(lán)染色,細(xì)胞漿可見(jiàn)大量紅色脂滴,少許肝細(xì)胞脂滴融合成大脂滴。各藥物干預(yù)組大鼠肝細(xì)胞脂滴紅染情況與模型組相比明顯縮小和減少,其中以疏肝組大鼠肝細(xì)胞含脂滴量與正常組最為接近。 見(jiàn)圖1。

        圖 1 各組大鼠肝組織病理變化 (油紅 O染色 ×200)Fig.1 Histopathological changes of liver tissuesw ith oil red O staining in each group( ×200)

        3.2.2 HE染色結(jié)果 正常組大鼠肝小葉輪廓清晰,肝竇結(jié)構(gòu)正常,肝索以中央靜脈為軸心呈放射狀排列,肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)豐富呈紅染,無(wú)空泡。模型組大鼠肝小葉輪廓欠清晰,肝索結(jié)構(gòu)紊亂,肝細(xì)胞腫脹,胞內(nèi)可見(jiàn)大小不等的空泡。各藥物干預(yù)組大鼠肝組織病理改變較模型組有不同程度的改善,以疏肝組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)與正常組最為相似。見(jiàn)圖2。

        圖 2 各組大鼠肝組織病理變化 (HE染色 ×200)Fig.2 H istopathological changes of liver tissues w ith HE staining in each group( ×200)

        3.3 各組大鼠血脂比較 與正常組比較, 模型組大鼠血清 TC、TG、LDL-C水平顯著升高 (P<0.01), HDL-C水平顯著降低 (P<0.01);與模型組比較, 各藥物干預(yù)組大鼠血清 TC、 LDL-C水平顯著降低 (P<0.05, P<0.01), 疏肝組大鼠血清TG水平顯著降低 (P<0.01),HDL-C水平顯著升高 (P<0.01);各藥物干預(yù)組間比較, 疏肝組大鼠血清 HDL-C水 平 明 顯 高 于 健 脾 組 及 合 方 組(P<0.01), LDL-C水平明顯低于健脾組及合方組(P<0.05, P<0.01)。 見(jiàn)表 2。

        表2 各組大鼠血脂比較 ()Tab.2 Com parison of serum lipid in each group()

        表2 各組大鼠血脂比較 ()Tab.2 Com parison of serum lipid in each group()

        注: 與正常組比較,▲▲P<0.01; 與模型組比較,★P<0.05,★★P<0.01; 與健脾組比較,■P<0.05,■■P<0.01; 與合方組比較,●●P<0.01

        組 別 動(dòng) 物數(shù) /只 TC/( mmol·L-1) TG/( mmol·L-1) HDL-C/( mmol·L-1) LDL-C/( mmol·L-1)正常組8 1.29 ±0.23 0.32 ±0.02 1.31 ±0.12 0.35 ±0.11模型組 8 3.84 ±1.06▲▲ 0.43 ±0.05▲▲ 0.85 ±0.11▲▲ 2.98 ±0.81▲▲疏肝組 9 2.26 ±0.60★ 0.30 ±0.06★★ 1.31 ±0.21★★■■●● 1.55 ±0.37★■●●健脾組 8 1.55 ±0.39★★ 0.36 ±0.09 1.01 ±0.15 0.91 ±0.40★★合方組 8 1.56 ±0.71★★ 0.35 ±0.06 0.96 ±0.21 0.93 ±0.21★★

        3.4 Kupffer細(xì)胞分離及鑒定

        3.4.1 細(xì)胞活性及產(chǎn)量 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 采用離體灌注Ⅳ型膠原酶、差速離心、密度梯度離心及選擇性貼壁法成功分離大鼠 Kupffer細(xì)胞,其中每只大鼠肝臟可分離 Kupffer細(xì)胞 2.0 ×107~3.0 ×107個(gè)。 Typan blue染色鑒定兩 細(xì)胞活 性均在 95% 以上。 見(jiàn)圖 3, 圖 4。

        圖 3 Kup ffer細(xì)胞分離Fig.3 Separation of Kup ffer cells

        圖 4 貼壁培養(yǎng) 3 h純化后的 Kup ffer細(xì)胞 ( ×100)Fig.4 Kupffer cellswere purified by adherent culture for 3 h

        3.4.2 FCM鑒定 Kupffer細(xì)胞純度 M1 為低濃度標(biāo)記峰標(biāo)志, M1平行線起點(diǎn)左側(cè)表示陰性細(xì)胞,起點(diǎn)右側(cè)移位峰表示陽(yáng)性細(xì)胞,起點(diǎn)左側(cè)的高峰為IgG陰性對(duì)照峰。 Lysozyme抗體檢測(cè) Kupffer細(xì)胞,共檢測(cè)細(xì)胞 1 ×104個(gè), 其中表達(dá) Lysozyme的細(xì)胞數(shù)是 9 121 個(gè), 比例為 91.21%, 即 Kupffer細(xì)胞純度為91.21%。 見(jiàn)圖 5。

        圖 5 FCM 鑒定 Kup ffer細(xì)胞純度Fig.5 The purity of Kupffer cellswas identificated by FCM

        3.5 Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c、 SCD-1 mRNA表達(dá)與正常組比較, 模型組 大鼠 Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c、 SCD-1 mRNA表達(dá)水平顯著升高 (P<0.01);與模型 組 比 較, 各藥物干 預(yù) 組 大鼠 Kupffer細(xì) 胞SREBP-1c mRNA表達(dá)水平顯著降低 ( P<0.01,P<0.05);各藥物干預(yù)組組間比較,疏肝組大鼠Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c mRNA表達(dá)水平明顯低于合方組 (P<0.05), SCD-1 mRNA表達(dá)水平明顯低于健脾組 (P<0.05)。提示 NAFLD大鼠 Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c通路相關(guān)基因呈高表達(dá),疏肝健脾方藥可顯著降低 NAFLD大鼠 Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c通路相關(guān)基因表達(dá)水平,以疏肝組作用最為顯著。見(jiàn)表3, 表4。

        表 3 Kup ffer細(xì) 胞 SREBP-1cm RNA表 達(dá) 水平 (, n=6)Tab.3 Exp ression levels of SREBP-1cmRNA in Kupffer cells(, n=6)

        表 3 Kup ffer細(xì) 胞 SREBP-1cm RNA表 達(dá) 水平 (, n=6)Tab.3 Exp ression levels of SREBP-1cmRNA in Kupffer cells(, n=6)

        注: 與正常組比較,▲▲P<0.01; 與模型組比較,★P<0.05,★★P<0.01; 與合方組比較,●P<0.05①標(biāo) 準(zhǔn)差 計(jì)算公 式為 : S= ()1/2, 如 0.86= ( 0.692+0.542 )1/2, 下 同。②標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算公式為: 2-ΔΔCT+s和 2-ΔΔCT-s, S 為 ΔΔCT的標(biāo)準(zhǔn)偏差, 如 2-(0+0.86)=0.55

        2-ΔΔCT SREBP-1c正常組 27.17 ±0.69 25.40 ±0.54 1.77 ±0.86① 0 ±0.86 1(0.55-1.82)組別 SREBP-1c Average.CT GAPDH Average.CT ΔCT SREBP-1c-GAPDH ΔΔCT ΔCT-ΔCT,Blank②模型組 24.51 ±0.57 25.67 ±0.59 -1.16 ±0.82 -2.93 ±0.82 7.62(4.32-13.45) ▲▲疏肝組 26.82 ±0.35 25.44 ±0.61 1.37 ±0.70 -0.40 ±0.70 1.32(0.81-2.14) ★★●健脾組 25.62 ±0.84 25.56 ±0.41 0.06 ±0.93 -1.71 ±0.93 3.27(1.72-6.23) ★合方組 25.08 ±0.52 25.47 ±0.26 -0.39 ±0.58 -2.16 ±0.58 4.47(2.99-6.68) ★

        3.6 Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c、 SCD-1 蛋白表達(dá) 與正常組比較, 模型組大鼠 Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c、SCD-1 蛋白表達(dá)水平顯著升高 (P<0.01); 與模型組比較,各藥物干預(yù)組大鼠 Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c、 SCD-1 蛋 白 表 達(dá) 顯 著 降 低 P<0.01, P<0.05)。 各用藥組組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。 見(jiàn)表 5, 圖 6。

        表 4 Kupffer細(xì)胞 SCD-1mRNA表達(dá)水平 (, n=6)Tab.4 Expression levels of SCD-1 m RNA in Kup ffer cells(, n=6)

        表 4 Kupffer細(xì)胞 SCD-1mRNA表達(dá)水平 (, n=6)Tab.4 Expression levels of SCD-1 m RNA in Kup ffer cells(, n=6)

        注: 與正常組比較,▲▲P<0.01; 與模型組比較,★P<0.05,★★P<0.01; 與健脾組比較,■P<0.05①標(biāo) 準(zhǔn)差 計(jì)算公 式為 : S= ()1/2, 如 1.07= ( 0.922+0.542 )1/2, 下 同。②標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算公式為: 2-ΔΔCT+s和 2-ΔΔCT-s, S 為 ΔΔCT的標(biāo)準(zhǔn)偏差, 如 2-(0+1.07)=0.48

        2-ΔΔCT SCD-1 Rel.to control正常組 31.26 ±0.92 25.40 ±0.54 5.86 ±1.07① 0 ±1.07 1(0.48-2.10)組別 SCD-1 Average.CT GAPDH Average.CT ΔCT SCD-1-GAPDH ΔΔCT ΔCT-ΔCT,Blank②模型組 28.94 ±1.32 25.67 ±0.59 3.27 ±1.45 -2.59 ±1.45 6.02(2.20-16.45) ▲▲疏肝組 30.63 ±0.75 25.44 ±0.61 5.19 ±0.97 -0.67 ±0.97 1.59(0.81-3.12) ★★■健脾組 29.18 ±0.61 25.56 ±0.41 3.62 ±0.73 -2.24 ±0.73 4.72(2.85-7.84)合方組 29.76 ±0.86 25.47 ±0.26 4.29 ±0.90 -1.57 ±0.90 2.97(1.59-5.54) ★

        表 5 Kup ffer細(xì) 胞 SREBP-1c信號(hào)通 路 相 關(guān) 蛋 白 表 達(dá) 水 平(, n=6)Tab.5 Expression levels of proteins involved in SREBP-1c signal pathway in Kup ffer cells(, n=6)

        表 5 Kup ffer細(xì) 胞 SREBP-1c信號(hào)通 路 相 關(guān) 蛋 白 表 達(dá) 水 平(, n=6)Tab.5 Expression levels of proteins involved in SREBP-1c signal pathway in Kup ffer cells(, n=6)

        注: 與正常組比較,*P<0.01; 與模型組比較,▲P<0.01,▲▲P<0.05

        組 別 ( SREBP-1c/GAPDH) ( SCD-1/GAPDH)正常組0.41 ±0.12 0.73 ±0.18模型組 0.89 ±0.08* 2.04 ±0.11*疏肝組 0.66 ±0.07▲ 0.87 ±0.09▲健脾組 0.69 ±0.03▲ 1.44 ±0.22▲▲合方組 0.67 ±0.06▲ 0.80 ±0.06▲

        圖 6 Kup ffer細(xì)胞 SREBP-1c、 SCD-1 蛋白灰度值比較Fig.6 Gray value of SREBP-1c and SCD-1 proteins in Kupffer cells

        4 討論

        祖國(guó)醫(yī)學(xué)無(wú) “非酒精性脂肪肝” 病名,根據(jù)NAFLD的臨床表現(xiàn), 大多把其歸屬于癥瘕、 積聚、脅痛、痰證、瘀證等病證范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病的發(fā)生多因嗜食肥甘厚味,過(guò)度肥胖,或恣飲酒漿,或情志失調(diào),或感受濕熱疫毒,或久病年老體虛等引起,與肝、脾、腎三臟功能失調(diào)密切相關(guān)?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究仍停留在假說(shuō)層面,目前比較為人們所接受的假說(shuō)是 1998 年 Day等[12]提出的 “二次打擊學(xué)說(shuō)”。 “初次打擊” 主要是胰島素抵抗和脂質(zhì)代謝紊亂所致的肝細(xì)胞脂肪變性,引起肝臟脂質(zhì)貯積,形成單純性脂肪肝; “二次打擊”主要為氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化、炎癥性細(xì)胞因子釋放等因素引起了脂肪性肝炎,進(jìn)而發(fā)生炎癥—壞死的惡性循環(huán),最終形成脂肪性肝纖維化或肝硬化等嚴(yán)重的病理變化。

        固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白 ( sterol regulatory element binding proteins, SREBPs) 屬于螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族,在脂肪酸、甘油三酯及膽固醇合成代謝中具有中心調(diào)控地位[13]。 SREBP-1c是目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的 SREBPs的 3 個(gè)亞型之一,在體內(nèi)大多數(shù)組織中均有表達(dá),以肝臟中表達(dá)較為豐富,主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)脂肪酸和甘油三酯的代謝[14]。 在 NAFLD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中, 通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子 SREBPs, 進(jìn)而調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)和葡萄糖平衡可能是 NAFLD的治療關(guān)鍵[15],抑制 SREBP-1c可以逆轉(zhuǎn)肝臟脂肪變性[16]。SCD-1 是一類催化飽和脂肪酸形成單不飽和脂肪酸的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白亞型之一,與酶系催化飽和脂肪酸生成的棕櫚油酰輔酶A和油酰輔酶A是體內(nèi)各種脂質(zhì)合成的底物,包括 TG、 膽固醇酯、 磷脂等。SCD-1 作為調(diào)節(jié)脂肪酸代謝的重要限速酶[17], 在脂肪酸合成代謝中起著重要的調(diào)節(jié)作用[18]。 研究 表明[19-20], NAFLD患者普遍存在肝臟 SCD-1 的激活, 肝臟脂肪百分比與 SCD-1 的激活呈正相關(guān), 血清脂肪酸的水平亦高度 依 賴 于 SCD-1 的 激 活。 此 外 SCD-1 作 為SREBP-1c調(diào)控的下 游基因, 當(dāng) SREBP-1c轉(zhuǎn)錄因子與 SCD-1 的啟動(dòng)子結(jié)合后, 可上調(diào) SCD-1 基因轉(zhuǎn)錄,最終導(dǎo)致脂質(zhì)合成增加,肝臟內(nèi)脂質(zhì)蓄積,促進(jìn) NAFLD的發(fā)展[4,21]。 Kupffer細(xì)胞, 又稱肝巨噬細(xì)胞, 約占體內(nèi)巨噬細(xì)胞的 80% ~90%, 是肝臟防御系統(tǒng)主要成員,其最主要的生理功能是迅速吞噬和清除對(duì)人體有害的外源性顆粒及免疫活性物質(zhì)。 Kupffer細(xì)胞與肝臟膽固醇和 TG的關(guān)系密切。NAFLD時(shí), Kupffer細(xì)胞不僅影響著肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂質(zhì)代謝的進(jìn)行, 而且 Kupffer細(xì)胞本身也存在著脂質(zhì)代謝障礙[22-23]。 Roth 等[23]給 予 SD大 鼠 高 脂 肪喂養(yǎng)后在電鏡下觀察到 Kupffer細(xì)胞內(nèi)含有大量脂肪空泡。研究表明,當(dāng)巨噬細(xì)胞脂肪酸增加,其中SCD的表達(dá)量會(huì)顯著增加,抑制 SCD表達(dá)后, 巨噬細(xì)胞中脂肪酸水平下降[24], 而抑制肝臟 Kupffer細(xì)胞 活 性 可 減 弱 SREBP-1c的 激 活 及 其靶 基 因SCD-1蛋 白 表達(dá) 水 平, 導(dǎo) 致 肝 臟 脂 質(zhì) 沉 積 形 成NAFLD[25]。 可 見(jiàn) 肝 臟 Kupffer細(xì) 胞 在 SREBP-1c/ SCD-1 信號(hào)通路激活引起脂質(zhì)沉積過(guò)程中起著重要的作用。 目前對(duì)于 SREBP-1c/SCD-1 等脂質(zhì)代謝相關(guān)信號(hào)通路的研究多著重于肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞中,對(duì)Kupffer細(xì)胞在該脂質(zhì)代謝通路中的作用機(jī)制研究相對(duì)較少。 鑒于此, 本實(shí) 驗(yàn)從 Kupffer細(xì)胞入手,以 SREBP-1c/SCD-1 信號(hào)通路為切入點(diǎn), 深入開展對(duì) NAFLD脂質(zhì)代謝紊亂機(jī)制及其防治研究。

        本實(shí)驗(yàn)中血脂以及病理學(xué)觀察結(jié)果表明,高脂飼料喂養(yǎng) 8 周建立大鼠 NAFLD模型存在明顯的脂質(zhì)代 謝 紊 亂, 可 能 與 模 型 組 大 鼠 Kupffer細(xì) 胞SREBP-1c、 SCD-1 mRNA及蛋白高度表達(dá)有關(guān)。 各藥物干預(yù)組 Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c、 SCD-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均有不同程度的下調(diào),同時(shí)血脂及病理組織學(xué)改變也較模型組有不同程度地改善,證實(shí)疏肝健脾方藥可能是通過(guò)抑制 NAFLD大鼠Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c信號(hào)通路激活, 使 TC、TG合成減少, 發(fā)揮抗 NAFLD的藥理作用。 SREBP-1c、 SCD-1 mRNA及蛋白可能是疏肝健脾方藥抗NAFLD的有效作用靶點(diǎn)。

        本課題組 前 期 研 究 表 明[6-7,26-28], 肝 郁 脾 虛 的病機(jī)貫穿于 NAFLD發(fā)病過(guò)程的始終, 確立以疏肝健脾法作為 NAFLD的基本治法。 肝郁脾虛證也是2010 年 12 月中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)脾胃病分會(huì)在制定的《非酒精性脂肪性肝病中醫(yī)診療共識(shí)意見(jiàn)》[29]中提出的 NAFLD的四個(gè)基本證候之一。 從中醫(yī)學(xué)證候?qū)W來(lái)看, 隨著病程的進(jìn)展, NAFLD可能或側(cè)重于肝郁、或脾虛、或肝郁脾虛并重等病機(jī)的特點(diǎn)。因此本實(shí)驗(yàn)采用疏肝方、健脾方、合方分別干預(yù)高脂飲食誘導(dǎo)的 NAFLD大鼠, 旨在從中醫(yī)病機(jī)角度揭示 8 周高脂飲食誘導(dǎo)的 NAFLD大鼠可能存在的病機(jī)特點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中觀察到疏肝方藥在改善血脂及病理組織學(xué)改變,下調(diào) Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c和SCD-1 mRNA水平明顯優(yōu)于健脾方和合方。 根據(jù)以方測(cè)證法,推測(cè)肝郁脾虛且以偏重肝郁可能是此階段 NAFLD的中醫(yī)基本病機(jī)之一。 隨著 NAFLD的進(jìn)一步發(fā)展,其病機(jī)又會(huì)發(fā)生怎樣的變化,值得進(jìn)一步研究。 此外, 疏肝健脾方藥防治 NAFLD可能是多途徑,多靶點(diǎn),多環(huán)節(jié)不同藥理作用的結(jié)果,詳細(xì)機(jī)制仍有必要繼續(xù)作進(jìn)一步的探討。

        [ 1 ] Cohen JC, Horton JD, Hobbs H H.Human fatty liver disease: old questions and new insights[ J] .Science, 2011 , 332(6037): 1519-1523.

        [ 2 ] Larter C Z, Chitturi S, Heydet D, etal.A fresh look at NASH pathogenesis.Part1: themetabolic movers[ J] .JGastroenterol Hepatol, 2010, 25(4) : 672-690.

        [ 3 ] Polyzos S A, Kountouras J, Zavos C, et al.The role of adiponectin in the pathogenesis and treatmentof non-alcoholic fatty liver disease[ J] .Diabetes Obes Metab, 2010, 12 ( 5 ):365-383.

        [ 4 ] Zhang C, Chen X, Zhu R M, et al.Endoplasmic reticulum stress is involved in hepatic SREBP-1c activation and lipid accumulation in fructose-fed mice[ J].Toxicol Lett, 2012, 212(3): 229-240.

        [5] 楊欽河,顧常霖,陳同炎,等.疏肝健脾方藥對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠肝組織脂肪酸合成酶 mRNA及蛋白表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志, 2011, 26(4): 843-846.

        [6] 楊欽河,周迎春,郭桃美,等.不同治法方藥對(duì)脂肪肝大鼠血脂作用的比 較研究 [J].新中醫(yī), 2004, 36 (5):74-75.

        [ 7] 李玉權(quán), 楊欽河.疏肝健脾法治療非酒精性脂肪肝 35 例[J].中醫(yī)雜志, 2007, 48(9): 824-825.

        [ 8 ] 段富津.方劑學(xué) [M].上海: 上??茖W(xué)技術(shù)出版社, 1995:114-179.

        [ 9 ] Yang Q H, Hu SP, Zhang Y P, et al.Effect of berberine on expressions of uncoupling protein-2 mRNA and protein of hepatic tissue in non-alcoholic fatty liver disease in rats[ J] .Chin J Integr Med, 2011, 17(3) : 205-211.

        [10] 王文晶, 楊欽河, 馮高飛, 等.疏肝健脾方藥對(duì) NASH大鼠心臟舒張功能及炎癥因子的影響[J].世界華人消化雜志, 2011, 19(25): 2615-2622.

        [11] 馮高飛, 楊欽河, 王文晶, 等.NASH大鼠肝細(xì)胞和庫(kù)普弗細(xì)胞同時(shí)分離及鑒 定[ J].廣東醫(yī)學(xué), 2012, 33 (1 ):30-34.

        [12 ] Day C P, James O F.Steatohepatitis: a tale of two“ hits”?[J] .Gastroenterology, 1998, 114(4) : 842-845.

        [13 ] Goldstein JL, Debose-Boyd R A, Brown M S.Protein sensors formembrane sterols[J] .Cell, 2006, 124(1) : 35-46.

        [14 ] Sato R.Sterolmetabolism and SREBP activation[ J].Arch Biochem Biophys, 2010, 501(2) : 177-181.

        [15 ] Ahmed M H, Byrne C D.Modulation of sterol regulatory element binding proteins( SREBPs) as potential treatments for non-alcoholic fatty liver disease( NAFLD) [ J] .Drug Discov Today, 2007, 12(17/18) : 740-747.

        [16 ] Vitto M F, Luz G, Luciano T F, etal.Reversion of steatosis by SREBP-1c antisense oligonucleotide did not improve hepatic in-sulin action in diet-induced obesitymice[J] .Horm Metab Res,2012, 44(12): 885-890.

        [17] Stryjecki C, Roke K, Clarke S, et al.Enzymatic activity and genetic variation in SCD1 modulate the relationship between fatty acids and inflammation [ J].Mol Genet Metab, 2012, 105(3): 421-427.

        [18] LIU X, Miyazaki M, Flowers M T, et al.Loss of stearoyl-CoA desaturase-1 attenuates adipocyte inflammation: effects of adipocyte-derived oleate[ J] .Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2010,30(1): 31-38.

        [19] Kotronen A, Seppanen-Laakso T, Westerbacka J, etal.Hepatic stearoyl-CoA desaturase( SCD) -1 activity and diacylglycerol but not ceramide concentrations are increased in the nonalcoholic human fatty liver[J] .Diabetes, 2009, 58(1) : 203-208.

        [20] Petersson H, Lind L, Hulthe J, et al.Relationships between serum fatty acid composition and multiplemarkers of inflammation and endothelial function in an elderly population[ J] .Atherosclerosis, 2009, 203(1) : 298-303.

        [21] Laplante M, Sabatini D M.mTORC1 activates SREBP-1c and uncouples lipogenesis from gluconeogenesis[ J] .Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(8): 3281-3282.

        [22] 朱明利, 施軍平.枯否細(xì)胞活化在非酒精性脂肪性肝病發(fā)生和發(fā)展中的作用[ J].中華肝臟病雜志, 2012, 20(9):718-720.

        [23] Roth B, Fkelund M, Fan B G, et al.Lipid deposition in Kupffer cells after parenteral fat nutrition in rats: a biochemical and ultrastructural study[ J] .Intensive Care Med, 1996, 22(11): 1224-1231.

        [24] Wong B X, Kyle R A, Myhill PC, etal.Dyslipidemic diabetic serum increases lipid accumulation and expr ession of stearoyl-CoA desaturase in human macrophages[ J] .Lipids, 2011, 46(10): 931-41.

        [25] 朱仁敏, 張 程, 陳 熙, 等.Kupffer細(xì)胞在果糖引起的非酒精性脂肪肝中的作用[ J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2012,47(3): 257-260.

        [26] 楊欽河, 謝 芳, 王鳳珍, 等.不同治法方藥對(duì)脂肪肝大鼠肝組織 NF-κBp65 及 Kupffer細(xì)胞 p38 MAPK蛋白表達(dá)的影響[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 26(2): 141-146.

        [27] 楊欽河, 凌家生, 平換換, 等.非酒精性脂肪肝的中醫(yī)藥防治研究思路與對(duì)策 [ J].中醫(yī)雜志, 2007, 48 (8):746-748.

        [28] 楊欽河, 歐 健, 孫升云, 等.疏肝健脾方藥對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠肝細(xì)胞 PI3K p85α蛋白表達(dá)的影響[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào), 2009, 25(1): 62-67.

        [29] 中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)脾胃病分會(huì).非酒精性脂肪性肝病中醫(yī)診療共識(shí)意見(jiàn)[J].北京中醫(yī)藥, 2011, 30(2): 83-86.

        Effects of soothing liver and invigorating sp leen recipes on SREBP-1c signal pathway related genes and proteins in Kup ffer cells of nonalcoholic fatty liver disease rats

        HAN Li1, YANG Qin-he2*, ZHANG Yu-pei2, XU Yong-jian2, LIU Yi-zhen2, YANG Xue-song3,JIN Ling1
        (1.The First Affiliated Hospitalof Jinan University, Guangzhou 510632, China; 2.Departmentof Traditional ChineseMedicine, Medical Collegeof Jinan University, Guangzhou 510632, China; 3.Department of Histology and Embryology, Medical College of Jinan University, Guangzhou 510632, China)

        AIM To explore effects of soothing liver and invigorating spleen recipes on sterol regulatory element binding proteins-1c(SREBP-1c) signal pathway related genes and proteins in Kupffer cells of nonalcoholic fatty liver disease( NAFLD) rats, and to study its possible preventive mechanism.METHODS The rats of NAFLDmodelwere induced by feeding a high-fat diet.The treatmentgroupswere given a gavage of soothing liver and invigorating spleen recipes.After treatment for 8 weeks, detecting routine blood biochemical indicator and liver tissue pathological changes, collagenase(TypeⅣ) was perfused to digest liver tissue with the circulation in vitro to separate Kupffer cells.Real-time Q-PCR and Western blotwere used to detect the expression levels of SREBP-1csignal pathway related genes and proteins.RESULTS The model group rats appeared hepatic fat accumulation obviously.Blood lipid and the expression levels of SREBP-1c, stearyl-CoA desaturase-1 ( SCD-1 ) genes and proteins in model group were higher than those in normal group.Compared with themodel group, SREBP-1c, SCD-1 genes and proteins decreased in all drug therapy groups.Levels of blood lipid and pathological changes showed different improvements, and the effect of soothing liver recipes was remarkable( P<0.01 ) .CONCLUSIONS Soothing liver and invigorating spleen recipes have good effect on NAFLD, which may be due to inhibiting the activation of SREBP-1c/SCD-1 in Kupffer cells, downing serum total cholesterol, triglyceride synthesis,reducing hepatic lipid deposition.SREBP-1c, SCD-1mRNA and proteinmay be effective targets for soothing liver and invigorating spleen recipes to treat NAFLD.

        soothing liver and invigorating spleen recipes; nonalcoholic fatty liver disease; sterol regulatory element binding proteins-1c;stearyl-CoA desaturase-1; Kupffer cells; rats

        R285.5

        : A

        : 1001-1528(2014)05-0885-08

        10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.001

        2013-06-12

        國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (81173216)

        韓 莉 (1963—), 女, 醫(yī)學(xué)碩士, 副主任醫(yī)師, 主要從事中醫(yī)藥治療代謝異常疾病及脂肪肝的臨床療效觀察及研究工作。Tel: 13826120177, E-mail: hanli168@aliyun.com

        *通信作者: 楊欽河 (1961—), 男, 醫(yī)學(xué)博士, 教授, 博士生導(dǎo)師, 從事中西醫(yī)結(jié)合防治慢性肝病及脂質(zhì)代謝疾病研究工作。 Tel:(020) 85226197 , E-mail: tyangqh@jnu.edu.cn

        猜你喜歡
        合方方藥疏肝
        Shugan Huoxue Huayu Fang (疏肝活血化瘀方) attenuates carbon tetrachloride-induced hepatic fibrosis in rats by inhibiting transforming growth factor-β1/Smad signaling
        Mechanism underlying efficacy of Shugan Sanjie decoction (疏肝散結(jié)湯) on plasma cell mastitis,based on network pharmacology and experimental verification
        基于“氣血水”學(xué)說(shuō)探討陳寶田教授運(yùn)用桂枝芍藥知母湯的合方思路
        家庭解酒方藥集錦
        中醫(yī)藥抗癌應(yīng)重視扶正方藥的應(yīng)用
        烏梅丸臨床應(yīng)用舉隅
        “體-量-效”方藥關(guān)系應(yīng)用探討
        疏肝和胃降逆湯治療反流性食管炎的效果觀察
        中醫(yī)治療高血壓病治法方藥研究進(jìn)展
        肺心合方聯(lián)合耳穴壓丸法治療肺心病急性加重期22例
        国内自拍视频在线观看h| 天天摸日日摸狠狠添| 国产精品露脸张开双腿| 精品丝袜一区二区三区性色| 亚洲av老熟女一区二区三区| 真实国产精品vr专区| 精品乱码久久久久久中文字幕| 免费a级毛片无码a∨免费| 一级一片内射视频网址| 色五月丁香五月综合五月| 久久久久99人妻一区二区三区| 精品亚洲一区二区三区在线观看 | 国产精品欧美成人片| 91国产自拍精品视频| 欧美又粗又长又爽做受| 好大好硬好爽免费视频| 天堂网av在线| 久久精品国产亚洲av性瑜伽| 亚洲伊人一本大道中文字幕| 国产精品18禁久久久久久久久| 日韩精品一区二区三区含羞含羞草 | 放荡成熟人妻中文字幕| 妺妺窝人体色www看美女| 亚洲成人福利在线观看| 冲田杏梨av天堂一区二区三区| 日本精品视频免费观看| 又粗又硬又黄又爽的免费视频| 亚洲精品国产品国语在线app| 国产又大大紧一区二区三区| 国产98色在线 | 国产| 四虎影视一区二区精品| 啪啪视频免费看一区二区| av影院在线免费观看不卡| 国产丝袜视频一区二区三区| 成人日韩av不卡在线观看| av免费观看网站大全| 国产又色又爽又黄的| 精品国产群3p在线观看| 国产精品成年人毛片毛片| 免费无遮挡无码永久视频| 日韩无码无播放器视频|