韓 莉， 楊欽河， 張玉佩， 徐擁建， 劉益臻， 楊雪松， 金 玲

（1.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 廣東 廣州 510632； 2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系， 廣東 廣州 510632； 3.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室， 廣東 廣州 510632）

［藥 理］

疏肝健脾方藥對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠 Kup ffer細(xì)胞 SREBP-1c信號(hào)通路相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響

韓 莉1， 楊欽河2*， 張玉佩2， 徐擁建2， 劉益臻2， 楊雪松3， 金 玲1

（1.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 廣東 廣州 510632； 2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系， 廣東 廣州 510632； 3.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室， 廣東 廣州 510632）

目的 觀 察 疏 肝 健 脾 方 藥 對(duì) 非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 病 （ NAFLD） 大 鼠 Kupffer細(xì) 胞 固 醇 調(diào) 節(jié) 元 件 結(jié) 合 蛋 白-1c（SREBP-1c） 信號(hào)通路相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響及可能的機(jī)制。 方法 采用高脂飼料喂養(yǎng)復(fù)制大鼠 NAFLD模型，各藥物干預(yù)組灌飼相應(yīng)的疏肝健脾方藥，8周后檢測(cè)血液常規(guī)生化指標(biāo)，觀察肝組織病理形態(tài)改變；采用離體循環(huán)灌注Ⅳ型膠原酶法提取肝 臟 Kupffer細(xì)胞， Q-PCR及 Western blot法檢 測(cè) Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c、 硬 脂酰輔酶 A去飽合酶-1 （ SCD-1） mRNA及蛋白 表 達(dá) 水 平。 結(jié) 果 模 型 組 大 鼠 肝 臟 脂 肪 蓄 積； 血 脂 及 Kupffer細(xì) 胞 SREBP-1c、 SCD-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平較正常組均顯著升高 （ P＜0.01 ） ； 各藥物干預(yù)組 Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c、 SCD-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均有不同程度的下調(diào)，同時(shí)血脂及病理學(xué)改變也較模型組有不同程度的改善， 以疏肝組作用最為顯著 （P＜0.01） 。 結(jié)論 疏肝健脾方藥可能是通過(guò)抑制 Kup ffer細(xì)胞 SREBP-1c/SCD-1 信號(hào)通路激活， 下調(diào)血清總膽固醇、 甘油三酯合成， 減少肝臟脂質(zhì)沉積， 發(fā)揮抗 NAFLD作用。 可推測(cè) SREBP-1c、 SCD-1 mRNA及蛋白可能是疏肝健脾方藥抗NAFLD的有效作用靶點(diǎn)。

疏肝健脾方藥； 非酒精性脂肪性肝病； 固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c； 硬脂酰輔酶 A去飽和酶-1； Kup ffer細(xì)胞；大鼠

非 酒 精 性 脂 肪 性 肝 病 （ nonalcoholic fatty liver disease， NAFLD） 是一種與遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)且無(wú)過(guò)量飲酒史、肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)貯積為特征的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪肝、非酒精 性 脂 肪 性 肝 炎 （ nonalcoholic steatohepatitis，NASH） 及 NASH相關(guān)肝纖維化、 肝硬化。 其發(fā)病非單一因素引起，可能與脂質(zhì)代謝障礙、胰島素抵抗、線粒體功能障礙、2型糖尿病、高血壓和其他一些代謝癥候群等密切相關(guān)［1-3］。 固醇調(diào)節(jié) 元件結(jié)合蛋白-1c（ sterol regulatory element binding proteins-1c， SREBP-1c） 和 硬 脂 酰 輔 酶 A 去 飽 和 酶-1（stearyl-CoA desaturase-1， SCD-1 ） 是 參 與脂 肪 酸合成代謝過(guò)程的重要調(diào)控因子。 研究表明， NAFLD時(shí)肝臟 SREBP-1c可激活下游多種參與脂肪酸和甘油三酯合成酶的轉(zhuǎn)錄， 包括 SCD-1、 脂肪酸合成酶、乙酰輔酶A羧化酶等，導(dǎo)致脂肪酸合成增加，造成肝臟脂質(zhì)蓄 積［4］。 本 課 題組前期研 究 發(fā) 現(xiàn)，疏肝健脾方藥可顯著改善 NAFLD大鼠肝臟脂質(zhì)代謝紊亂， 減輕肝臟脂肪變性， 防治 NAFLD作用療效確切［5-7］。 本 實(shí) 驗(yàn) 觀 察 疏 肝 健 脾 方 藥 對(duì) NAFLD大鼠肝臟 Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c/SCD-1 信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響， 探討其抗 NAFLD的干預(yù)作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 雄性 SD大鼠， SPF級(jí)， 6 周齡， 體質(zhì)量 （200 ±20） g， 廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)： SCXK （粵） 2008-0020， 合格批號(hào) 0107792。

1.2 主要儀器與試劑 AU600 全自動(dòng)生化分析儀（日本 Olympus公司） ； ELITE流式細(xì) 胞儀 （ 美國(guó)BECKMAN-COULTER公司）； KDS200 雙通道注射泵 （美國(guó) KD Scientific公司）； CFX Manager實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀 （美國(guó) BIO-RAD公司）。 Trizol裂解液 （批號(hào) D9108A）、 Quant cDNA第一鏈合成試劑盒 （ 批 號(hào) DRR047A）、 SYBR Green 熒光 定 量PCR試劑盒 （批號(hào) DRR820A）均購(gòu)自日本 Takara公 司； SREBP-1c Antibody（ 批 號(hào) GR111569-1 ）、SCD-1 Antibody（ 批 號(hào) GR91951-1 ） 均 購(gòu) 自 美 國(guó)Abcam公司； 兔抗大鼠 Anti-Lysozyme（批號(hào) Y-Bo-07J26C）購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司； Ⅳ型膠原酶 （ 批號(hào) C8160-100） 購(gòu)自美國(guó) GBICO公司； Nycodenz細(xì)胞分離液 （批號(hào) 1002424-1） 購(gòu)自瑞典 Axis-shield 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥材 方藥組成及飲片劑量均參照 《方劑學(xué)》 教 材［8］。 疏 肝 方 藥 （ 柴 胡 疏 肝 散： 柴 胡6 g， 川芎5 g， 枳殼 5 g， 陳皮 6 g， 白芍5 g， 香附5 g，炙甘草 3 g）、健脾方藥 （參苓白術(shù)散：人參15 g， 白術(shù) 15 g， 茯苓 15 g，薏苡仁9 g， 砂仁 6 g，山藥 15 g， 桔梗 6 g， 白扁豆 12 g， 蓮子 9 g， 炙甘草 9 g）、 合方 （柴胡疏肝散與參苓白術(shù)散合用方）中藥材均為深圳華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)的免煎單味中藥配方顆粒，購(gòu)自暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房。免煎中藥配方顆粒按包裝說(shuō)明換算成實(shí)驗(yàn)所需的飲片劑量，溶于水制成水溶劑。其中疏肝方 含 生 藥 量 0.96 g/mL； 健 脾 方 含 生 藥 量3.00 g/mL； 合方含生藥量 3.96 g/mL。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及處理 將大鼠隨機(jī)分為正常組、 模型組、 疏肝組、健脾組、合方組， 每組 15 只。NAFLD大鼠模型建立在本課題組以往的造模方法［9］的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)， 建立 NAFLD大鼠模型。 除正常組大鼠給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)外，其余各組大鼠均以高脂飼料 （基礎(chǔ)飼料 88%，豬油10%， 膽固醇 1.5%，3 號(hào) 膽 鹽 0.5%） 喂 養(yǎng) 造 模。 同 時(shí) 各 組 按10 mL/（kg體質(zhì)量）給予相應(yīng)的藥物或蒸餾水灌胃。本課題組前期［10］已探討不同疏肝健脾方藥劑量對(duì)NAFLD大鼠的干預(yù)作用， 表明人臨床等效劑量的3倍用量在改善 NAFLD大鼠肝功能，降低血脂、肝脂，減輕肝臟脂肪變性療效更為顯著。因此本實(shí)驗(yàn)采用成人臨床等效劑量的3倍用量，疏肝組為9.6 g/（kg·d），健脾組為 30 g/（kg·d），合方組為39.6 g/（kg·d）。 每日上午 8 ∶00 灌胃 1 次，1周稱體質(zhì)量1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量，連續(xù)8 周。 各組動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于 22 ～26 ℃， 明暗各12 h的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)， 自由飲水進(jìn)食。 實(shí)驗(yàn)期間觀察大鼠毛色、體態(tài)、食欲、行為狀態(tài)、大小便及對(duì)外界刺激的反應(yīng)。

2.2 標(biāo)本采集 第 8 周后， 禁食 12 h， 每組 8 ～9只大鼠 （注：因灌胃不當(dāng)，正常組、模型組、健脾組及合方組大鼠各死亡1只）以 3%戊巴比妥鈉按 0.1 mL/（kg體質(zhì)量）腹腔麻醉， 腹主動(dòng)脈采血，距離肝邊緣 0.5 cm處取相同部位肝右葉組織若干，-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?其余 6 只用以分離Kupffer細(xì)胞。

2.3 肝組織觀察 距離肝邊緣 0.5 cm處取相同部位肝右葉小塊約 1.5 cm×1 cm×0.5 cm， 冰凍切片作油紅O染色觀察肝細(xì)胞內(nèi)脂滴的分布情況。另若干小塊以 10%中性甲醛溶液固定， 常規(guī)石蠟包埋， 作4μm連續(xù)切片行 HE染色， 光鏡下觀察大鼠肝臟脂肪變性情況。需要注意的是脂滴極易降解，因此取肝組織后應(yīng)當(dāng)日即行油紅O染色。

2.4 血脂檢測(cè) 采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清血清總膽固醇 （TC）、 甘油三酯 （TG）、 高密度脂蛋白 膽 固 醇 （ HDL-C）、 低 密 度 脂 蛋 白 膽 固 醇（LDL-C）水平。

2.5 Kupffer細(xì)胞分離及鑒定 采用離體循環(huán)灌注Ⅳ 型 膠 原 酶 法 提 取 Kupffer細(xì) 胞， 流 式 細(xì) 胞 術(shù)（flow cytometry， FCM） 鑒定細(xì)胞純度， 具體分離與鑒定 方 法 詳見(jiàn)本課 題 組 已 發(fā) 表 論 文［11］， 不 再贅述。

2.6 Q-PCR法檢測(cè) Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c、 SCD-1 mRNA表達(dá)水平 采用 Trizol裂解肝細(xì)胞， 提取總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)總 RNA水平，然后逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。 引物設(shè)計(jì)依據(jù) Genebank 采用 Primer 5.0軟件以 GAPDH基因序列為內(nèi)參照物， 由上海捷瑞生物工程有限公司合成， 引物序列見(jiàn)表 1。 PCR擴(kuò)增采用25 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為90 ℃預(yù)變性，持 續(xù) 30 min； 95 ℃ 變 性， 持 續(xù) 5 s； GAPDH、 SREBP-1c、 SCD-1 均為 58 ℃， 退火 20 s； 60 ℃延伸， 持續(xù) 45 s， 39 個(gè)循環(huán)； 溶解曲線分析， 65 ～95 ℃， 持續(xù) 5 ～10 s。 反應(yīng)完畢， 用 Opticon Monitor 3.1 軟件處理結(jié)果， 設(shè)定正常組基因表達(dá)水平為 1。 公式 2-ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組目的基因表達(dá)相對(duì)于正常組 的 變 化 倍 數(shù)。 ΔΔCt=實(shí) 驗(yàn) 組 （ Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因） -空白組 （Ct目的基因-Ct內(nèi)參其因）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.7 Western blot法檢測(cè) Kupffer細(xì) 胞 SREBP-1c、SCD-1 蛋白表達(dá)水平 每 5 ×106個(gè)細(xì)胞加入 1 mL RIPA裂 解 液 （含 PMSF） ， 吹 打 混 勻 后，4 ℃，14 000 r/min，離心 8 min，取 上 清 BCA法 測(cè) 定 總蛋白濃度， 調(diào)整樣品上樣量終質(zhì)量濃度為 50～80 μg/μL。 注意為避免蛋白降解， 全程都應(yīng)在冰臺(tái)上操作。 經(jīng) SDS-PAGE電泳分離蛋白， 然后轉(zhuǎn)移至 PVDF膜上， 加 5%脫脂奶粉封閉液， 室溫下平搖1 h； 洗膜， 加一抗稀釋液4℃過(guò)夜孵育； 洗膜， 加二抗稀釋液室溫孵育1 h， 洗膜后， 進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。 用 Quantity One軟件分析內(nèi)參與目的蛋白的光密度值，統(tǒng)計(jì)分析。

2.8 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 處 理 計(jì) 量 資 料 以 均 數(shù) ±標(biāo) 準(zhǔn) 差（） 表 示， 采 用 SPSS 19.0 進(jìn) 行 統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 處 理，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)用SNK （ Student-Newman-Keuls， 即 q檢 驗(yàn) ） 法 進(jìn) 行組間兩兩比較， 方差不齊時(shí)用 Tamhane’s T2 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn) P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 動(dòng)物一般狀況 正常組大鼠毛色光澤，飲食、排泄物較正常，性情溫順，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏。模型組大鼠體毛略黃而干枯，體型肥胖，大便油膩感質(zhì)略稀，對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍，容易激惹。各用藥組大鼠一般情況介于正常組和模型組大鼠之間。

3.2 肝組織病理學(xué)觀察

3.2.1 油紅 O染色結(jié)果 正常組大鼠肝細(xì)胞核呈淡藍(lán)染色，少許肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)散在的紅染脂滴。模型組大鼠肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核呈深藍(lán)染色，細(xì)胞漿可見(jiàn)大量紅色脂滴，少許肝細(xì)胞脂滴融合成大脂滴。各藥物干預(yù)組大鼠肝細(xì)胞脂滴紅染情況與模型組相比明顯縮小和減少，其中以疏肝組大鼠肝細(xì)胞含脂滴量與正常組最為接近。 見(jiàn)圖1。

圖 1 各組大鼠肝組織病理變化 （油紅 O染色 ×200）Fig.1 Histopathological changes of liver tissuesw ith oil red O staining in each group（ ×200）

3.2.2 HE染色結(jié)果 正常組大鼠肝小葉輪廓清晰，肝竇結(jié)構(gòu)正常，肝索以中央靜脈為軸心呈放射狀排列，肝細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)豐富呈紅染，無(wú)空泡。模型組大鼠肝小葉輪廓欠清晰，肝索結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞腫脹，胞內(nèi)可見(jiàn)大小不等的空泡。各藥物干預(yù)組大鼠肝組織病理改變較模型組有不同程度的改善，以疏肝組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)與正常組最為相似。見(jiàn)圖2。

圖 2 各組大鼠肝組織病理變化 （HE染色 ×200）Fig.2 H istopathological changes of liver tissues w ith HE staining in each group（ ×200）

3.3 各組大鼠血脂比較 與正常組比較， 模型組大鼠血清 TC、TG、LDL-C水平顯著升高 （P＜0.01）， HDL-C水平顯著降低 （P＜0.01）；與模型組比較， 各藥物干預(yù)組大鼠血清 TC、 LDL-C水平顯著降低 （P＜0.05， P＜0.01）， 疏肝組大鼠血清TG水平顯著降低 （P＜0.01），HDL-C水平顯著升高 （P＜0.01）；各藥物干預(yù)組間比較， 疏肝組大鼠血清 HDL-C水 平 明 顯 高 于 健 脾 組 及 合 方 組（P＜0.01）， LDL-C水平明顯低于健脾組及合方組（P＜0.05， P＜0.01）。 見(jiàn)表 2。

表2 各組大鼠血脂比較 （）Tab.2 Com parison of serum lipid in each group（）

表2 各組大鼠血脂比較 （）Tab.2 Com parison of serum lipid in each group（）

注： 與正常組比較，▲▲P＜0.01； 與模型組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01； 與健脾組比較，■P＜0.05，■■P＜0.01； 與合方組比較，●●P＜0.01

組 別 動(dòng) 物數(shù) /只 TC/（ mmol·L-1） TG/（ mmol·L-1） HDL-C/（ mmol·L-1） LDL-C/（ mmol·L-1）正常組8 1.29 ±0.23 0.32 ±0.02 1.31 ±0.12 0.35 ±0.11模型組 8 3.84 ±1.06▲▲ 0.43 ±0.05▲▲ 0.85 ±0.11▲▲ 2.98 ±0.81▲▲疏肝組 9 2.26 ±0.60★ 0.30 ±0.06★★ 1.31 ±0.21★★■■●● 1.55 ±0.37★■●●健脾組 8 1.55 ±0.39★★ 0.36 ±0.09 1.01 ±0.15 0.91 ±0.40★★合方組 8 1.56 ±0.71★★ 0.35 ±0.06 0.96 ±0.21 0.93 ±0.21★★

3.4 Kupffer細(xì)胞分離及鑒定

3.4.1 細(xì)胞活性及產(chǎn)量 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 采用離體灌注Ⅳ型膠原酶、差速離心、密度梯度離心及選擇性貼壁法成功分離大鼠 Kupffer細(xì)胞，其中每只大鼠肝臟可分離 Kupffer細(xì)胞 2.0 ×107～3.0 ×107個(gè)。 Typan blue染色鑒定兩 細(xì)胞活 性均在 95% 以上。 見(jiàn)圖 3， 圖 4。

圖 3 Kup ffer細(xì)胞分離Fig.3 Separation of Kup ffer cells

圖 4 貼壁培養(yǎng) 3 h純化后的 Kup ffer細(xì)胞 （ ×100）Fig.4 Kupffer cellswere purified by adherent culture for 3 h

3.4.2 FCM鑒定 Kupffer細(xì)胞純度 M1 為低濃度標(biāo)記峰標(biāo)志， M1平行線起點(diǎn)左側(cè)表示陰性細(xì)胞，起點(diǎn)右側(cè)移位峰表示陽(yáng)性細(xì)胞，起點(diǎn)左側(cè)的高峰為IgG陰性對(duì)照峰。 Lysozyme抗體檢測(cè) Kupffer細(xì)胞，共檢測(cè)細(xì)胞 1 ×104個(gè)， 其中表達(dá) Lysozyme的細(xì)胞數(shù)是 9 121 個(gè)， 比例為 91.21%， 即 Kupffer細(xì)胞純度為91.21%。 見(jiàn)圖 5。

圖 5 FCM 鑒定 Kup ffer細(xì)胞純度Fig.5 The purity of Kupffer cellswas identificated by FCM

3.5 Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c、 SCD-1 mRNA表達(dá)與正常組比較， 模型組 大鼠 Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c、 SCD-1 mRNA表達(dá)水平顯著升高 （P＜0.01）；與模型 組 比 較， 各藥物干 預(yù) 組 大鼠 Kupffer細(xì) 胞SREBP-1c mRNA表達(dá)水平顯著降低 （ P＜0.01，P＜0.05）；各藥物干預(yù)組組間比較，疏肝組大鼠Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c mRNA表達(dá)水平明顯低于合方組 （P＜0.05）， SCD-1 mRNA表達(dá)水平明顯低于健脾組 （P＜0.05）。提示 NAFLD大鼠 Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c通路相關(guān)基因呈高表達(dá)，疏肝健脾方藥可顯著降低 NAFLD大鼠 Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c通路相關(guān)基因表達(dá)水平，以疏肝組作用最為顯著。見(jiàn)表3， 表4。

表 3 Kup ffer細(xì) 胞 SREBP-1cm RNA表 達(dá) 水平 （， n=6）Tab.3 Exp ression levels of SREBP-1cmRNA in Kupffer cells（， n=6）

表 3 Kup ffer細(xì) 胞 SREBP-1cm RNA表 達(dá) 水平 （， n=6）Tab.3 Exp ression levels of SREBP-1cmRNA in Kupffer cells（， n=6）

注： 與正常組比較，▲▲P＜0.01； 與模型組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01； 與合方組比較，●P＜0.05①標(biāo) 準(zhǔn)差 計(jì)算公 式為 ： S= （）1/2， 如 0.86= （ 0.692+0.542 ）1/2， 下 同。②標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算公式為： 2-ΔΔCT+s和 2-ΔΔCT-s， S 為 ΔΔCT的標(biāo)準(zhǔn)偏差， 如 2-（0+0.86）=0.55

2-ΔΔCT SREBP-1c正常組 27.17 ±0.69 25.40 ±0.54 1.77 ±0.86① 0 ±0.86 1（0.55-1.82）組別 SREBP-1c Average.CT GAPDH Average.CT ΔCT SREBP-1c-GAPDH ΔΔCT ΔCT-ΔCT，Blank②模型組 24.51 ±0.57 25.67 ±0.59 -1.16 ±0.82 -2.93 ±0.82 7.62（4.32-13.45） ▲▲疏肝組 26.82 ±0.35 25.44 ±0.61 1.37 ±0.70 -0.40 ±0.70 1.32（0.81-2.14） ★★●健脾組 25.62 ±0.84 25.56 ±0.41 0.06 ±0.93 -1.71 ±0.93 3.27（1.72-6.23） ★合方組 25.08 ±0.52 25.47 ±0.26 -0.39 ±0.58 -2.16 ±0.58 4.47（2.99-6.68） ★

3.6 Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c、 SCD-1 蛋白表達(dá) 與正常組比較， 模型組大鼠 Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c、SCD-1 蛋白表達(dá)水平顯著升高 （P＜0.01）； 與模型組比較，各藥物干預(yù)組大鼠 Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c、 SCD-1 蛋 白 表 達(dá) 顯 著 降 低 P＜0.01， P＜0.05）。 各用藥組組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。 見(jiàn)表 5， 圖 6。

表 4 Kupffer細(xì)胞 SCD-1mRNA表達(dá)水平 （， n=6）Tab.4 Expression levels of SCD-1 m RNA in Kup ffer cells（， n=6）

表 4 Kupffer細(xì)胞 SCD-1mRNA表達(dá)水平 （， n=6）Tab.4 Expression levels of SCD-1 m RNA in Kup ffer cells（， n=6）

注： 與正常組比較，▲▲P＜0.01； 與模型組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01； 與健脾組比較，■P＜0.05①標(biāo) 準(zhǔn)差 計(jì)算公 式為 ： S= （）1/2， 如 1.07= （ 0.922+0.542 ）1/2， 下 同。②標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算公式為： 2-ΔΔCT+s和 2-ΔΔCT-s， S 為 ΔΔCT的標(biāo)準(zhǔn)偏差， 如 2-（0+1.07）=0.48

2-ΔΔCT SCD-1 Rel.to control正常組 31.26 ±0.92 25.40 ±0.54 5.86 ±1.07① 0 ±1.07 1（0.48-2.10）組別 SCD-1 Average.CT GAPDH Average.CT ΔCT SCD-1-GAPDH ΔΔCT ΔCT-ΔCT，Blank②模型組 28.94 ±1.32 25.67 ±0.59 3.27 ±1.45 -2.59 ±1.45 6.02（2.20-16.45） ▲▲疏肝組 30.63 ±0.75 25.44 ±0.61 5.19 ±0.97 -0.67 ±0.97 1.59（0.81-3.12） ★★■健脾組 29.18 ±0.61 25.56 ±0.41 3.62 ±0.73 -2.24 ±0.73 4.72（2.85-7.84）合方組 29.76 ±0.86 25.47 ±0.26 4.29 ±0.90 -1.57 ±0.90 2.97（1.59-5.54） ★

表 5 Kup ffer細(xì) 胞 SREBP-1c信號(hào)通 路 相 關(guān) 蛋 白 表 達(dá) 水 平（， n=6）Tab.5 Expression levels of proteins involved in SREBP-1c signal pathway in Kup ffer cells（， n=6）

表 5 Kup ffer細(xì) 胞 SREBP-1c信號(hào)通 路 相 關(guān) 蛋 白 表 達(dá) 水 平（， n=6）Tab.5 Expression levels of proteins involved in SREBP-1c signal pathway in Kup ffer cells（， n=6）

注： 與正常組比較，*P＜0.01； 與模型組比較，▲P＜0.01，▲▲P＜0.05

組 別 （ SREBP-1c/GAPDH） （ SCD-1/GAPDH）正常組0.41 ±0.12 0.73 ±0.18模型組 0.89 ±0.08* 2.04 ±0.11*疏肝組 0.66 ±0.07▲ 0.87 ±0.09▲健脾組 0.69 ±0.03▲ 1.44 ±0.22▲▲合方組 0.67 ±0.06▲ 0.80 ±0.06▲

圖 6 Kup ffer細(xì)胞 SREBP-1c、 SCD-1 蛋白灰度值比較Fig.6 Gray value of SREBP-1c and SCD-1 proteins in Kupffer cells

4 討論

祖國(guó)醫(yī)學(xué)無(wú) “非酒精性脂肪肝” 病名，根據(jù)NAFLD的臨床表現(xiàn)， 大多把其歸屬于癥瘕、 積聚、脅痛、痰證、瘀證等病證范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病的發(fā)生多因嗜食肥甘厚味，過(guò)度肥胖，或恣飲酒漿，或情志失調(diào)，或感受濕熱疫毒，或久病年老體虛等引起，與肝、脾、腎三臟功能失調(diào)密切相關(guān)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究仍停留在假說(shuō)層面，目前比較為人們所接受的假說(shuō)是 1998 年 Day等［12］提出的 “二次打擊學(xué)說(shuō)”。 “初次打擊” 主要是胰島素抵抗和脂質(zhì)代謝紊亂所致的肝細(xì)胞脂肪變性，引起肝臟脂質(zhì)貯積，形成單純性脂肪肝； “二次打擊”主要為氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化、炎癥性細(xì)胞因子釋放等因素引起了脂肪性肝炎，進(jìn)而發(fā)生炎癥—壞死的惡性循環(huán)，最終形成脂肪性肝纖維化或肝硬化等嚴(yán)重的病理變化。

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白 （ sterol regulatory element binding proteins， SREBPs） 屬于螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族，在脂肪酸、甘油三酯及膽固醇合成代謝中具有中心調(diào)控地位［13］。 SREBP-1c是目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的 SREBPs的 3 個(gè)亞型之一，在體內(nèi)大多數(shù)組織中均有表達(dá)，以肝臟中表達(dá)較為豐富，主要負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)脂肪酸和甘油三酯的代謝［14］。 在 NAFLD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中， 通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子 SREBPs， 進(jìn)而調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)和葡萄糖平衡可能是 NAFLD的治療關(guān)鍵［15］，抑制 SREBP-1c可以逆轉(zhuǎn)肝臟脂肪變性［16］。SCD-1 是一類催化飽和脂肪酸形成單不飽和脂肪酸的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白亞型之一，與酶系催化飽和脂肪酸生成的棕櫚油酰輔酶A和油酰輔酶A是體內(nèi)各種脂質(zhì)合成的底物，包括 TG、 膽固醇酯、 磷脂等。SCD-1 作為調(diào)節(jié)脂肪酸代謝的重要限速酶［17］， 在脂肪酸合成代謝中起著重要的調(diào)節(jié)作用［18］。 研究 表明［19-20］， NAFLD患者普遍存在肝臟 SCD-1 的激活， 肝臟脂肪百分比與 SCD-1 的激活呈正相關(guān)， 血清脂肪酸的水平亦高度 依 賴 于 SCD-1 的 激 活。 此 外 SCD-1 作 為SREBP-1c調(diào)控的下 游基因， 當(dāng) SREBP-1c轉(zhuǎn)錄因子與 SCD-1 的啟動(dòng)子結(jié)合后， 可上調(diào) SCD-1 基因轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致脂質(zhì)合成增加，肝臟內(nèi)脂質(zhì)蓄積，促進(jìn) NAFLD的發(fā)展［4，21］。 Kupffer細(xì)胞， 又稱肝巨噬細(xì)胞， 約占體內(nèi)巨噬細(xì)胞的 80% ～90%， 是肝臟防御系統(tǒng)主要成員，其最主要的生理功能是迅速吞噬和清除對(duì)人體有害的外源性顆粒及免疫活性物質(zhì)。 Kupffer細(xì)胞與肝臟膽固醇和 TG的關(guān)系密切。NAFLD時(shí)， Kupffer細(xì)胞不僅影響著肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂質(zhì)代謝的進(jìn)行， 而且 Kupffer細(xì)胞本身也存在著脂質(zhì)代謝障礙［22-23］。 Roth 等［23］給 予 SD大 鼠 高 脂 肪喂養(yǎng)后在電鏡下觀察到 Kupffer細(xì)胞內(nèi)含有大量脂肪空泡。研究表明，當(dāng)巨噬細(xì)胞脂肪酸增加，其中SCD的表達(dá)量會(huì)顯著增加，抑制 SCD表達(dá)后， 巨噬細(xì)胞中脂肪酸水平下降［24］， 而抑制肝臟 Kupffer細(xì)胞 活 性 可 減 弱 SREBP-1c的 激 活 及 其靶 基 因SCD-1蛋 白 表達(dá) 水 平， 導(dǎo) 致 肝 臟 脂 質(zhì) 沉 積 形 成NAFLD［25］。 可 見(jiàn) 肝 臟 Kupffer細(xì) 胞 在 SREBP-1c/ SCD-1 信號(hào)通路激活引起脂質(zhì)沉積過(guò)程中起著重要的作用。 目前對(duì)于 SREBP-1c/SCD-1 等脂質(zhì)代謝相關(guān)信號(hào)通路的研究多著重于肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞中，對(duì)Kupffer細(xì)胞在該脂質(zhì)代謝通路中的作用機(jī)制研究相對(duì)較少。 鑒于此， 本實(shí) 驗(yàn)從 Kupffer細(xì)胞入手，以 SREBP-1c/SCD-1 信號(hào)通路為切入點(diǎn)， 深入開展對(duì) NAFLD脂質(zhì)代謝紊亂機(jī)制及其防治研究。

本實(shí)驗(yàn)中血脂以及病理學(xué)觀察結(jié)果表明，高脂飼料喂養(yǎng) 8 周建立大鼠 NAFLD模型存在明顯的脂質(zhì)代 謝 紊 亂， 可 能 與 模 型 組 大 鼠 Kupffer細(xì) 胞SREBP-1c、 SCD-1 mRNA及蛋白高度表達(dá)有關(guān)。 各藥物干預(yù)組 Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c、 SCD-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均有不同程度的下調(diào)，同時(shí)血脂及病理組織學(xué)改變也較模型組有不同程度地改善，證實(shí)疏肝健脾方藥可能是通過(guò)抑制 NAFLD大鼠Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c信號(hào)通路激活， 使 TC、TG合成減少， 發(fā)揮抗 NAFLD的藥理作用。 SREBP-1c、 SCD-1 mRNA及蛋白可能是疏肝健脾方藥抗NAFLD的有效作用靶點(diǎn)。

本課題組 前 期 研 究 表 明［6-7，26-28］， 肝 郁 脾 虛 的病機(jī)貫穿于 NAFLD發(fā)病過(guò)程的始終， 確立以疏肝健脾法作為 NAFLD的基本治法。 肝郁脾虛證也是2010 年 12 月中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)脾胃病分會(huì)在制定的《非酒精性脂肪性肝病中醫(yī)診療共識(shí)意見(jiàn)》［29］中提出的 NAFLD的四個(gè)基本證候之一。 從中醫(yī)學(xué)證候?qū)W來(lái)看， 隨著病程的進(jìn)展， NAFLD可能或側(cè)重于肝郁、或脾虛、或肝郁脾虛并重等病機(jī)的特點(diǎn)。因此本實(shí)驗(yàn)采用疏肝方、健脾方、合方分別干預(yù)高脂飲食誘導(dǎo)的 NAFLD大鼠， 旨在從中醫(yī)病機(jī)角度揭示 8 周高脂飲食誘導(dǎo)的 NAFLD大鼠可能存在的病機(jī)特點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中觀察到疏肝方藥在改善血脂及病理組織學(xué)改變，下調(diào) Kupffer細(xì)胞 SREBP-1c和SCD-1 mRNA水平明顯優(yōu)于健脾方和合方。 根據(jù)以方測(cè)證法，推測(cè)肝郁脾虛且以偏重肝郁可能是此階段 NAFLD的中醫(yī)基本病機(jī)之一。 隨著 NAFLD的進(jìn)一步發(fā)展，其病機(jī)又會(huì)發(fā)生怎樣的變化，值得進(jìn)一步研究。 此外， 疏肝健脾方藥防治 NAFLD可能是多途徑，多靶點(diǎn)，多環(huán)節(jié)不同藥理作用的結(jié)果，詳細(xì)機(jī)制仍有必要繼續(xù)作進(jìn)一步的探討。

［ 1 ］ Cohen JC， Horton JD， Hobbs H H.Human fatty liver disease： old questions and new insights［ J］ .Science， 2011 ， 332（6037）： 1519-1523.

［ 2 ］ Larter C Z， Chitturi S， Heydet D， etal.A fresh look at NASH pathogenesis.Part1： themetabolic movers［ J］ .JGastroenterol Hepatol， 2010， 25（4） ： 672-690.

［ 3 ］ Polyzos S A， Kountouras J， Zavos C， et al.The role of adiponectin in the pathogenesis and treatmentof non-alcoholic fatty liver disease［ J］ .Diabetes Obes Metab， 2010， 12 （ 5 ）：365-383.

［ 4 ］ Zhang C， Chen X， Zhu R M， et al.Endoplasmic reticulum stress is involved in hepatic SREBP-1c activation and lipid accumulation in fructose-fed mice［ J］.Toxicol Lett， 2012， 212（3）： 229-240.

［5］ 楊欽河，顧常霖，陳同炎，等.疏肝健脾方藥對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠肝組織脂肪酸合成酶 mRNA及蛋白表達(dá)的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志， 2011， 26（4）： 843-846.

［6］ 楊欽河，周迎春，郭桃美，等.不同治法方藥對(duì)脂肪肝大鼠血脂作用的比 較研究 ［J］.新中醫(yī)， 2004， 36 （5）：74-75.

［ 7］ 李玉權(quán)， 楊欽河.疏肝健脾法治療非酒精性脂肪肝 35 例［J］.中醫(yī)雜志， 2007， 48（9）： 824-825.

［ 8 ］ 段富津.方劑學(xué) ［M］.上海： 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社， 1995：114-179.

［ 9 ］ Yang Q H， Hu SP， Zhang Y P， et al.Effect of berberine on expressions of uncoupling protein-2 mRNA and protein of hepatic tissue in non-alcoholic fatty liver disease in rats［ J］ .Chin J Integr Med， 2011， 17（3） ： 205-211.

［10］ 王文晶， 楊欽河， 馮高飛， 等.疏肝健脾方藥對(duì) NASH大鼠心臟舒張功能及炎癥因子的影響［J］.世界華人消化雜志， 2011， 19（25）： 2615-2622.

［11］ 馮高飛， 楊欽河， 王文晶， 等.NASH大鼠肝細(xì)胞和庫(kù)普弗細(xì)胞同時(shí)分離及鑒 定［ J］.廣東醫(yī)學(xué)， 2012， 33 （1 ）：30-34.

［12 ］ Day C P， James O F.Steatohepatitis： a tale of two“ hits”？［J］ .Gastroenterology， 1998， 114（4） ： 842-845.

［13 ］ Goldstein JL， Debose-Boyd R A， Brown M S.Protein sensors formembrane sterols［J］ .Cell， 2006， 124（1） ： 35-46.

［14 ］ Sato R.Sterolmetabolism and SREBP activation［ J］.Arch Biochem Biophys， 2010， 501（2） ： 177-181.

［15 ］ Ahmed M H， Byrne C D.Modulation of sterol regulatory element binding proteins（ SREBPs） as potential treatments for non-alcoholic fatty liver disease（ NAFLD） ［ J］ .Drug Discov Today， 2007， 12（17/18） ： 740-747.

［16 ］ Vitto M F， Luz G， Luciano T F， etal.Reversion of steatosis by SREBP-1c antisense oligonucleotide did not improve hepatic in-sulin action in diet-induced obesitymice［J］ .Horm Metab Res，2012， 44（12）： 885-890.

［17］ Stryjecki C， Roke K， Clarke S， et al.Enzymatic activity and genetic variation in SCD1 modulate the relationship between fatty acids and inflammation ［ J］.Mol Genet Metab， 2012， 105（3）： 421-427.

［18］ LIU X， Miyazaki M， Flowers M T， et al.Loss of stearoyl-CoA desaturase-1 attenuates adipocyte inflammation： effects of adipocyte-derived oleate［ J］ .Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2010，30（1）： 31-38.

［19］ Kotronen A， Seppanen-Laakso T， Westerbacka J， etal.Hepatic stearoyl-CoA desaturase（ SCD） -1 activity and diacylglycerol but not ceramide concentrations are increased in the nonalcoholic human fatty liver［J］ .Diabetes， 2009， 58（1） ： 203-208.

［20］ Petersson H， Lind L， Hulthe J， et al.Relationships between serum fatty acid composition and multiplemarkers of inflammation and endothelial function in an elderly population［ J］ .Atherosclerosis， 2009， 203（1） ： 298-303.

［21］ Laplante M， Sabatini D M.mTORC1 activates SREBP-1c and uncouples lipogenesis from gluconeogenesis［ J］ .Proc Natl Acad Sci USA， 2010， 107（8）： 3281-3282.

［22］ 朱明利， 施軍平.枯否細(xì)胞活化在非酒精性脂肪性肝病發(fā)生和發(fā)展中的作用［ J］.中華肝臟病雜志， 2012， 20（9）：718-720.

［23］ Roth B， Fkelund M， Fan B G， et al.Lipid deposition in Kupffer cells after parenteral fat nutrition in rats： a biochemical and ultrastructural study［ J］ .Intensive Care Med， 1996， 22（11）： 1224-1231.

［24］ Wong B X， Kyle R A， Myhill PC， etal.Dyslipidemic diabetic serum increases lipid accumulation and expr ession of stearoyl-CoA desaturase in human macrophages［ J］ .Lipids， 2011， 46（10）： 931-41.

［25］ 朱仁敏， 張 程， 陳 熙， 等.Kupffer細(xì)胞在果糖引起的非酒精性脂肪肝中的作用［ J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2012，47（3）： 257-260.

［26］ 楊欽河， 謝 芳， 王鳳珍， 等.不同治法方藥對(duì)脂肪肝大鼠肝組織 NF-κBp65 及 Kupffer細(xì)胞 p38 MAPK蛋白表達(dá)的影響［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2009， 26（2）： 141-146.

［27］ 楊欽河， 凌家生， 平換換， 等.非酒精性脂肪肝的中醫(yī)藥防治研究思路與對(duì)策 ［ J］.中醫(yī)雜志， 2007， 48 （8）：746-748.

［28］ 楊欽河， 歐 健， 孫升云， 等.疏肝健脾方藥對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠肝細(xì)胞 PI3K p85α蛋白表達(dá)的影響［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)， 2009， 25（1）： 62-67.

［29］ 中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)脾胃病分會(huì).非酒精性脂肪性肝病中醫(yī)診療共識(shí)意見(jiàn)［J］.北京中醫(yī)藥， 2011， 30（2）： 83-86.

Effects of soothing liver and invigorating sp leen recipes on SREBP-1c signal pathway related genes and proteins in Kup ffer cells of nonalcoholic fatty liver disease rats

HAN Li1， YANG Qin-he2*， ZHANG Yu-pei2， XU Yong-jian2， LIU Yi-zhen2， YANG Xue-song3，JIN Ling1
（1.The First Affiliated Hospitalof Jinan University， Guangzhou 510632， China； 2.Departmentof Traditional ChineseMedicine， Medical Collegeof Jinan University， Guangzhou 510632， China； 3.Department of Histology and Embryology， Medical College of Jinan University， Guangzhou 510632， China）

AIM To explore effects of soothing liver and invigorating spleen recipes on sterol regulatory element binding proteins-1c（SREBP-1c） signal pathway related genes and proteins in Kupffer cells of nonalcoholic fatty liver disease（ NAFLD） rats， and to study its possible preventive mechanism.METHODS The rats of NAFLDmodelwere induced by feeding a high-fat diet.The treatmentgroupswere given a gavage of soothing liver and invigorating spleen recipes.After treatment for 8 weeks， detecting routine blood biochemical indicator and liver tissue pathological changes， collagenase（TypeⅣ） was perfused to digest liver tissue with the circulation in vitro to separate Kupffer cells.Real-time Q-PCR and Western blotwere used to detect the expression levels of SREBP-1csignal pathway related genes and proteins.RESULTS The model group rats appeared hepatic fat accumulation obviously.Blood lipid and the expression levels of SREBP-1c， stearyl-CoA desaturase-1 （ SCD-1 ） genes and proteins in model group were higher than those in normal group.Compared with themodel group， SREBP-1c， SCD-1 genes and proteins decreased in all drug therapy groups.Levels of blood lipid and pathological changes showed different improvements， and the effect of soothing liver recipes was remarkable（ P＜0.01 ） .CONCLUSIONS Soothing liver and invigorating spleen recipes have good effect on NAFLD， which may be due to inhibiting the activation of SREBP-1c/SCD-1 in Kupffer cells， downing serum total cholesterol， triglyceride synthesis，reducing hepatic lipid deposition.SREBP-1c， SCD-1mRNA and proteinmay be effective targets for soothing liver and invigorating spleen recipes to treat NAFLD.

soothing liver and invigorating spleen recipes； nonalcoholic fatty liver disease； sterol regulatory element binding proteins-1c；stearyl-CoA desaturase-1； Kupffer cells； rats

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）05-0885-08

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.001

2013-06-12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 （81173216）

韓 莉 （1963—）， 女， 醫(yī)學(xué)碩士， 副主任醫(yī)師， 主要從事中醫(yī)藥治療代謝異常疾病及脂肪肝的臨床療效觀察及研究工作。Tel： 13826120177， E-mail： hanli168@aliyun.com

*通信作者： 楊欽河 （1961—）， 男， 醫(yī)學(xué)博士， 教授， 博士生導(dǎo)師， 從事中西醫(yī)結(jié)合防治慢性肝病及脂質(zhì)代謝疾病研究工作。 Tel：（020） 85226197 ， E-mail： tyangqh@jnu.edu.cn