張江國+龔鳳云+李玲+等

張江國1 龔鳳云2 李 玲1 宋建新1

1.華中科技大學附屬同濟醫(yī)院感染科，湖北武漢 430030；2.武漢市普愛醫(yī)院，湖北武漢 430030

[摘要] 目的 觀察肝硬化模型中腎臟中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（NGAL）表達與腎功能受損之間的關系。 方法 選擇60只SD雄性大鼠，其中27大鼠在建模過程中死亡，5只SD雄性大鼠作為空白對照，28只SD雄性大鼠經持續(xù)服用四氯化碳誘導形成肝硬化腹水模型，按照免疫組化檢測腎臟表達NGAL的強度和陽性細胞數(shù)建立不同級別組：低度表達組，中度表達組，高度表達組，極高表達組。Western blot測定各組NGAL的表達，并通過檢測蛋白條帶的光密度值進行半定量分析。通過全自動生化分析儀測定肌酐（Cr）及尿素氮（BUN）。 結果 28只大鼠出現(xiàn)肝硬化腹水，Western blot半定量檢測發(fā)現(xiàn)各組之間差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），極高表達組表達量最高，而高度表達組、中度表達組、低度表達組表達量依次降低；腎臟NGAL的表達越強，大鼠血中BUN、Cr升高的越多，且差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。腎臟NGAL表達主要分布在近曲腎小管及遠端腎單位。 結論 在肝硬化腹水腎臟功能損傷時，腎臟NGAL 主要分布于近曲腎小管及遠端腎單位，且其表達提示腎臟損傷程度。

[關鍵詞] 肝硬化模型；腎功能受損；中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白；腎臟

[中圖分類號] R446.11 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）03（c）-0017-04

Correlation between kidney expression of neutrophil gelatinase-associated lipocalin and renal function impairment in liver cirrhosis

ZHANG Jiangguo1 GONG Fengyun2 LI Ling1 SONG Jianxin1

1.Department of Infectious Diseases， Tongji Hospital Affiliated to Huazhong University of Science and Technology， Hubei Province， Wuhan 430030， China； 2.Department of Infectious Diseases， Pu′ai Hospital of Wuhan， Hubei Province， Wuhan 430030， China

[Abstract] Objective To observe the relationship between kidney expression of neutrophil gelatinase-associated lipocalin （NGAL） and renal function in a rat liver cirrhosis model. Methods A total of 60 male Sprague Dawley （SD） rats were included in this experiment. 27 rats were died during the process of model building， 5 male SD rats were used as control， 28 male SD rats were induced into liver cirrhosis with ascites through periodic carbon tetrachloride intragastric administration. Different groups such as slight staining group， moderate staining group， intense staining group， highly intense staining group were divided according to the NGAL expression intensity and NGAL positive cell number detected by immunohistochemistry. Then the protein expression of NGAL was further examined by Western blot and semi-quantified by densitometry. Automatic biochemistry analyzer was employed to measure blood urea nitrogen （BUN） and serum Creatinine （Cr）. Results 28 animals with cirrhosis developed ascites. Western blot analysis revealed that there were significant differences among those different groups （P < 0.05）. The expression of NGAL in highly intense staining group was highest. The expression of NGAL was stepwise decreased from intense staining group to moderate staining group and slight staining group. BUN， Cr levels in blood elevated as NGAL expression in kidney increased （P < 0.05）. Furthermore， NGAL distributed primarily in proximal tubules and distal nephron segments in these groups. Conclusion In the rat liver cirrhosis model with impaired renal function， NGAL primarily distributes in proximal tubules and distal nephron segments. The NGAL staining intensity is correlated with the degree of renal function impairment.

[Key words] Liver cirrhosis model； Renal function impairment； Neutrophil gelatinase-associated lipocalin； Kidney

中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）是脂質運載蛋白家族中的一個新成員，最初被發(fā)現(xiàn)能結合細菌鐵載體進而阻止鐵元素吸收入細菌從而抑制細菌活性[1]。近幾年，有學者發(fā)現(xiàn)高劑量腹腔內注射能引起腎小管壞死的順鉑，能快速誘導腎臟NGAL的表達及從腎小管細胞釋放[2]。也有學者報道指出腎小管在短時間缺血損傷后腎小管會高表達NGAL[3]。腎臟NGAL的表達是腎移植時腎臟缺血損傷的早期指標[4]。肝硬化時腎功能受損及肝腎綜合征時，血和尿中NGAL表達增多是腎功能受損的敏感指標[5-6]。但是在肝硬化腎功能受損時，NGAL在腎臟的表達及與腎功能受損之間的關系還不是很清楚，因此本研究初步研究了大鼠肝硬化模型中腎臟NGAL的表達與腎功能損害之間的關系。這將為腎臟NGAL 表達變化與肝硬化腎臟損傷之間的關系提供直接的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

雄性SD大鼠60只，SPF級，體重150～200 g，購于自湖北省實驗動物中心，飼養(yǎng)于同濟醫(yī)院實驗動物中心SPF級屏障環(huán)境。四氯化碳購自天津德恩化學試劑有限公司，免疫組化及Western blot NGAL一抗購自美國Abnova公司，免疫組化二抗試劑盒購自上?；蚩萍加邢薰?，Western blot二抗及配膠、轉膜、顯影試劑購自武漢谷歌生物科技有限公司。

1.2 模型制作

重量大于200 g的SD大鼠，標準飼料喂養(yǎng)，其中5只SD雄性大鼠作為空白對照，55只SD雄性大鼠持續(xù)使用無菌無熱原灌胃針經胃給四氯化碳，首次劑量為20 μL，后續(xù)計量根據(jù)上次劑量灌胃后48 h體重變化調整。等腹水出現(xiàn)后，四氯化碳劑量減至20 μL，12～16周后，肝硬化腹水模型建立[7]。

1.3 免疫組化法測定腎臟NGAL表達

收集的大鼠腎臟標本首先經過10%的甲醛固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、烤片、脫蠟、水化、抗原修復、NGAL一抗4℃冰箱過夜、二抗37℃孵育10 min、DAB顯色、PBS終止染色、封片等。按照文獻[8]所示方法進行分級，NGAL的染色強度分為0～3分，0分為無染色，1分為弱染色，2分為中等程度染色，3分為強染色。NGAL染色百分比分為0～3分，其中0分為陽性細胞數(shù)所占百分比為0，1分為<25%，2分為25%～50%，3分為>50%。綜合上述兩者得分，其中低度表達組得分為0，1，2分，中度表達組得分為3，4分，高度表達組得分為6分，NGAL極高度表達組得分為9分。

1.4 Western blot測定腎臟NGAL表達

取肝硬化大鼠腎臟組織稱重，液氮、研缽磨碎組織塊，每克組織加3 mL含PMSF的RIPA裂解液，4℃下玻璃勻漿器勻漿，冰上孵育30 min；4℃，15 000 r/min離心15 min，Bradford比色法測定上清液蛋白質濃度，蛋白質煮沸變性，等量上樣，電泳，電轉膜儀轉膜，顯色，分析比較記錄。

1.5 腎功能測定

采集大鼠血液，分離出血清，采用Olympus AU21000型全自動生化分析儀測定尿素氮（BUN）及肌酐（Cr）。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 模型建立

本實驗中，對照組有5只大鼠。55只大鼠用來建立模型，在此過程中27只大鼠死亡，28只出現(xiàn)肝硬化腹水。

2.2 分組及NGAL在肝硬化腎功能損傷時腎臟表達的部位情況

按照免疫組化腎臟表達NGAL的強度和陽性細胞數(shù)建立不同級別組：NGAL低度表達組，NGAL中度表達組，NGAL高度表達組，NGAL極高度表達組，其中低度表達組有大鼠14只，中度表達組有大鼠7只，高度表達組有大鼠4只，極高表達組有3只。在上述四組中，腎臟NGAL表達主要分布在近曲腎小管及遠端腎單位，腎小球未見明顯分布。見圖1。

A為低度表達組，B為中度表達組，C為高度表達組，D為極高度表達組；箭頭所指為NGAL表達的部位

圖1 大鼠肝硬化模型腎臟NGAL表達免疫組化結果

2.3 不同組別NGAL的相對表達量

進一步進行Western blot 檢測了不同組之間的NGAL相對表達量，和上述結果相似，極高表達組的NGAL相對表達量（NGAL/β-actin）為1.0063±0.0159，高度表達組NGAL相對表達量為0.8543±0.0054，中度表達組NGAL相對表達量為0.7074±0.0191，低度表達組NGAL相對表達量為0.4535±0.0143；腎臟NGAL在極高度表達組明顯高于其他三組，而高度表達組明顯高于中低度表達組，中度表達組又高于低度表達組且上述差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖2。

A為低度表達組，B為中度表達組，C為高度表達組，D為極高度表達組；與A組比較，*P < 0.05

圖2 大鼠肝硬化模型腎臟NGAL表達Western blot結果及蛋白條帶的半定量分析

2.4 腎臟NGAL表達強度與大鼠血中BUN、Cr的關系

從低度、中度表達組到高度、極高度表達組，隨著NGAL表達強度的增強，血Cr，BUN在各組間呈遞增變化，且各組間差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見表1。

表1 大鼠肝硬化模型不同NGAL表達組

腎功能BUN、Cr表達變化（x±s）

注：A為低度表達組，B為中度表達組，C為高度表達組，D為極高度表達組；與A組比較，*P < 0.05；BUN：尿素氮；Cr：肌酐

3 討論

腎功能障礙特別是肝腎綜合征，是晚期肝硬化患者最常見的臨床并發(fā)癥，主要由于全身或內臟動脈舒張、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、交感神經系統(tǒng)和非滲透性的血管加壓素等神經介質系統(tǒng)的激活引起腎血管收縮、腎血流量減少、腎皮質灌注不足所引起的急性腎臟損傷[9]。尿中的NGAL能夠分層診斷肝硬化患者腎功能損害及確診肝硬化患者的急性腎臟損傷[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)在肝硬化動物模型中，腎臟NGAL的表達與腎功能受損密切相關，且NGAL主要表達在功能受損的腎臟近曲腎小管及遠端腎單位。

肝硬化患者尿液中的NGAL變化能敏感地提示肝硬化腎功能受損及損傷的程度[10-11]，和上述結果相似，在本肝硬化模型中腎臟NGAL 表達提示腎臟功能損害程度。隨著NGAL表達強度的增強，血BUN及Cr在各組間呈遞增變化。這為肝硬化時腎臟NGAL表達與肝硬化時腎臟功能損害之間的關系提供直接證據(jù)。而對于急性腎臟損傷時NGAL表達增加的機制目前還不是太清楚，可能為在急性腎損傷時，腎臟遠側腎單位為了修復損傷的腎小管上皮細胞而合成和釋放NGAL[12]，進一步需進行肝硬化患者腎臟穿刺活檢檢測NGAL表達并進行明確的機制研究。

在腎臟缺血性損傷的動物模型中，近曲腎小管NGAL表達與損傷修復有密切關系[3]。在腎小管細胞培養(yǎng)過程中，NGAL能夠促進上皮細胞形成[13]。肝硬化腎臟功能損傷時NGAL主要分布在近曲腎小管及遠端腎單位。這可能與NGAL參與腎小管損傷修復有關。另外，NGAL 參與鐵的轉運，鐵離子可能會對腎小管細胞有毒性作用，在腎小管細胞受損傷時，NGAL可能作為鐵離子的儲存庫以阻止鐵離子對腎小管上皮細胞的毒性損害作用。這些都需要進一步的機制研究以明確NGAL 在肝硬化腎功能損傷中的作用及機制。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)肝硬化腎臟功能損傷時腎臟NGAL主要分布于近曲腎小管及遠端腎單位，且其表達提示腎臟損傷程度。這為肝硬化腎臟損傷與腎臟NGAL的表達提供直接的證據(jù)。

[參考文獻]

[1] Goetz DH， Holmes MA， Borregaard N， et al. The neutrophil lipocalin NGAL is a bacteriostatic agent that interferes with siderophore-mediated iron acquisition [J]. Mol Cell，2002，10（5）：1033-1043.

[2] Mishra J， Mori K， Ma Q， et al. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin： a novel early urinary biomarker for cisplatin nephrotoxicity[J]. Am J Nephrol，2004，24（3）：307-315.

[3] Mishra J， Ma Q， Prada A， et al. Identification of neutrophil gelatinase-associated lipocalin as a novel early urinary biomarker for ischemic renal injury[J]. J Am Soc Nephrol，2003，14（10）：2534-2543.

[4] Mishra J， Ma Q， Kelly C， et al. Kidney NGAL is a novel early marker of acute injury following transplantation[J]. Pediatr Nephrol，2006，21（6）：856-863.

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[8] Sun Y， Yokoi K， Li H， et al. NGAL expression is elevated in both colorectal adenoma-carcinoma Sequence and cancer progression and enhances tumorigenesis in xenograft mouse models[J]. Clin Cancer Res，2011，17（13）：4331-4340.

[9] 王宇明，朱鵬.終末期肝病中的急性腎損傷與肝腎綜合征[J].中華肝臟病雜志，2013，21（3）：173-176.

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[11] Verna EC， Brown RS， Farrand E， et al. Urinary neutrophil gelatinase-associated lipocalin predicts mortality and identifies acute kidney injury in cirrhosis[J]. Digest Dis Sci，2012，57（9）：2362-2370.

[12] Gungor G， Ataseven H， Demir A， et al. Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin in prediction of mortality in Patients with Hepatorenal Syndrome： a prospective observational study [J]. Liver Int，2014，34：49-57.

[13] Gwira JA， Wei F， Ishibe S， et al. Expression of neutrophil gelatinase-associated lipocalin regulates epithelial morphogenesis in vitro[J]. J Biol Chem，2005，280（9）：7875-7882.

（收稿日期：2013-11-31 本文編輯：衛(wèi) 軻）

表1 大鼠肝硬化模型不同NGAL表達組

腎功能BUN、Cr表達變化（x±s）

注：A為低度表達組，B為中度表達組，C為高度表達組，D為極高度表達組；與A組比較，*P < 0.05；BUN：尿素氮；Cr：肌酐

3 討論

腎功能障礙特別是肝腎綜合征，是晚期肝硬化患者最常見的臨床并發(fā)癥，主要由于全身或內臟動脈舒張、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、交感神經系統(tǒng)和非滲透性的血管加壓素等神經介質系統(tǒng)的激活引起腎血管收縮、腎血流量減少、腎皮質灌注不足所引起的急性腎臟損傷[9]。尿中的NGAL能夠分層診斷肝硬化患者腎功能損害及確診肝硬化患者的急性腎臟損傷[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)在肝硬化動物模型中，腎臟NGAL的表達與腎功能受損密切相關，且NGAL主要表達在功能受損的腎臟近曲腎小管及遠端腎單位。

肝硬化患者尿液中的NGAL變化能敏感地提示肝硬化腎功能受損及損傷的程度[10-11]，和上述結果相似，在本肝硬化模型中腎臟NGAL 表達提示腎臟功能損害程度。隨著NGAL表達強度的增強，血BUN及Cr在各組間呈遞增變化。這為肝硬化時腎臟NGAL表達與肝硬化時腎臟功能損害之間的關系提供直接證據(jù)。而對于急性腎臟損傷時NGAL表達增加的機制目前還不是太清楚，可能為在急性腎損傷時，腎臟遠側腎單位為了修復損傷的腎小管上皮細胞而合成和釋放NGAL[12]，進一步需進行肝硬化患者腎臟穿刺活檢檢測NGAL表達并進行明確的機制研究。

在腎臟缺血性損傷的動物模型中，近曲腎小管NGAL表達與損傷修復有密切關系[3]。在腎小管細胞培養(yǎng)過程中，NGAL能夠促進上皮細胞形成[13]。肝硬化腎臟功能損傷時NGAL主要分布在近曲腎小管及遠端腎單位。這可能與NGAL參與腎小管損傷修復有關。另外，NGAL 參與鐵的轉運，鐵離子可能會對腎小管細胞有毒性作用，在腎小管細胞受損傷時，NGAL可能作為鐵離子的儲存庫以阻止鐵離子對腎小管上皮細胞的毒性損害作用。這些都需要進一步的機制研究以明確NGAL 在肝硬化腎功能損傷中的作用及機制。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)肝硬化腎臟功能損傷時腎臟NGAL主要分布于近曲腎小管及遠端腎單位，且其表達提示腎臟損傷程度。這為肝硬化腎臟損傷與腎臟NGAL的表達提供直接的證據(jù)。

[參考文獻]

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[13] Gwira JA， Wei F， Ishibe S， et al. Expression of neutrophil gelatinase-associated lipocalin regulates epithelial morphogenesis in vitro[J]. J Biol Chem，2005，280（9）：7875-7882.

（收稿日期：2013-11-31 本文編輯：衛(wèi) 軻）

表1 大鼠肝硬化模型不同NGAL表達組

腎功能BUN、Cr表達變化（x±s）

注：A為低度表達組，B為中度表達組，C為高度表達組，D為極高度表達組；與A組比較，*P < 0.05；BUN：尿素氮；Cr：肌酐

3 討論

腎功能障礙特別是肝腎綜合征，是晚期肝硬化患者最常見的臨床并發(fā)癥，主要由于全身或內臟動脈舒張、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、交感神經系統(tǒng)和非滲透性的血管加壓素等神經介質系統(tǒng)的激活引起腎血管收縮、腎血流量減少、腎皮質灌注不足所引起的急性腎臟損傷[9]。尿中的NGAL能夠分層診斷肝硬化患者腎功能損害及確診肝硬化患者的急性腎臟損傷[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)在肝硬化動物模型中，腎臟NGAL的表達與腎功能受損密切相關，且NGAL主要表達在功能受損的腎臟近曲腎小管及遠端腎單位。

肝硬化患者尿液中的NGAL變化能敏感地提示肝硬化腎功能受損及損傷的程度[10-11]，和上述結果相似，在本肝硬化模型中腎臟NGAL 表達提示腎臟功能損害程度。隨著NGAL表達強度的增強，血BUN及Cr在各組間呈遞增變化。這為肝硬化時腎臟NGAL表達與肝硬化時腎臟功能損害之間的關系提供直接證據(jù)。而對于急性腎臟損傷時NGAL表達增加的機制目前還不是太清楚，可能為在急性腎損傷時，腎臟遠側腎單位為了修復損傷的腎小管上皮細胞而合成和釋放NGAL[12]，進一步需進行肝硬化患者腎臟穿刺活檢檢測NGAL表達并進行明確的機制研究。

在腎臟缺血性損傷的動物模型中，近曲腎小管NGAL表達與損傷修復有密切關系[3]。在腎小管細胞培養(yǎng)過程中，NGAL能夠促進上皮細胞形成[13]。肝硬化腎臟功能損傷時NGAL主要分布在近曲腎小管及遠端腎單位。這可能與NGAL參與腎小管損傷修復有關。另外，NGAL 參與鐵的轉運，鐵離子可能會對腎小管細胞有毒性作用，在腎小管細胞受損傷時，NGAL可能作為鐵離子的儲存庫以阻止鐵離子對腎小管上皮細胞的毒性損害作用。這些都需要進一步的機制研究以明確NGAL 在肝硬化腎功能損傷中的作用及機制。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)肝硬化腎臟功能損傷時腎臟NGAL主要分布于近曲腎小管及遠端腎單位，且其表達提示腎臟損傷程度。這為肝硬化腎臟損傷與腎臟NGAL的表達提供直接的證據(jù)。

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[7] Guarner C， Runyon BA， Young S， et al. Intestinal bacterial overgrowth and bacterial translocation in cirrhotic rats with ascites [J]. J Hepatol，1997，26（6）：1372-1378.

[8] Sun Y， Yokoi K， Li H， et al. NGAL expression is elevated in both colorectal adenoma-carcinoma Sequence and cancer progression and enhances tumorigenesis in xenograft mouse models[J]. Clin Cancer Res，2011，17（13）：4331-4340.

[9] 王宇明，朱鵬.終末期肝病中的急性腎損傷與肝腎綜合征[J].中華肝臟病雜志，2013，21（3）：173-176.

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[13] Gwira JA， Wei F， Ishibe S， et al. Expression of neutrophil gelatinase-associated lipocalin regulates epithelial morphogenesis in vitro[J]. J Biol Chem，2005，280（9）：7875-7882.

（收稿日期：2013-11-31 本文編輯：衛(wèi) 軻）