許佩蘭
(河南省安陽(yáng)市中醫(yī)院,河南 安陽(yáng) 455000)
HPLC法測(cè)定金菊利咽顆粒中綠原酸的含量
許佩蘭
(河南省安陽(yáng)市中醫(yī)院,河南 安陽(yáng) 455000)
目的建立金菊利咽顆粒中綠原酸的含量測(cè)定方法,提高金菊利咽顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法通過(guò)以綠原酸為考察指標(biāo),采用HΡLC法測(cè)定金菊利咽顆粒中綠原酸的含量。結(jié)果采用HΡLC法測(cè)定綠原酸含量作為定量控制的指標(biāo),可有效控制金菊利咽顆粒的質(zhì)量。暫定本品每袋含金銀花以綠原酸(C16H18O9)計(jì),不得少于13 mg。結(jié)論該方法操作簡(jiǎn)便,結(jié)果準(zhǔn)確,靈敏度高,重現(xiàn)性好,方法學(xué)考察表明該方法準(zhǔn)確可靠,可有效控制金菊利咽顆粒的質(zhì)量。
金菊利咽顆粒;金銀花;綠原酸;HΡLC
金菊利咽顆粒系安陽(yáng)市中醫(yī)院協(xié)定處方,由金銀花、野菊花、射干等組成。功效:清熱解毒,消腫利咽。用于慢性咽炎,咽喉疼痛等。經(jīng)多年臨床應(yīng)用,療效確切,為方便患者服用,特制成顆粒劑,并取得制劑批準(zhǔn)文號(hào)(豫藥制字Z05050082)。為了保證制劑質(zhì)量和臨床療效,采用高效液相色譜法對(duì)制劑中的金銀花以綠原酸為指標(biāo)進(jìn)行定量鑒別分析。有文獻(xiàn)報(bào)道野菊花[1]中含有綠原酸。筆者采用高效液相色譜法測(cè)定制劑中綠原酸含量,方法操作簡(jiǎn)便,結(jié)果準(zhǔn)確,靈敏度高,重現(xiàn)性好,方法學(xué)考察表明該方法準(zhǔn)確可靠,可有效控制金菊利咽顆粒的質(zhì)量。
1.1 儀器:LC-2010A高效液相色譜儀(島津,包括SΡD-10Avp紫外檢測(cè)器,CLASS-VΡ工作站);賽多利斯BT125D分析天平;KQ-50B型超聲波提取器。
1.2 試藥:綠原酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):110753-200413,供含量測(cè)定用);金菊利咽顆粒(安陽(yáng)市中醫(yī)院生產(chǎn)、提供,批號(hào):20130301、20130302、20130303);甲醇(色譜純);乙腈(色譜純);磷酸(分析純);水為重蒸餾水。
2.1 色譜條件
色譜柱:Agilent Extend-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈-0.4%磷酸溶液(12∶88)[3-4];流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):327 nm[5];柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。此條件下綠原酸與其他組分達(dá)到基線分離,分離度R>1.5。
2.2 對(duì)照品溶液的制備
精密稱取干燥至恒重的綠原酸對(duì)照品10.09 mg,置50 mL棕色量瓶中,加入50%甲醇溶液少許,超聲溶解,50%甲醇溶液定容至刻度,搖勻,得對(duì)照品儲(chǔ)備液,再精密移取5 mL儲(chǔ)備液,置100 mL棕色量瓶中,50%甲醇溶液定容至刻度,即得對(duì)照品溶液(0.01009g/L)。
2.3 供試品溶液的制備
取裝量差異項(xiàng)下的本品,研細(xì),取約1 g,精密稱定,置50 mL棕色量瓶中,加50%甲醇40 mL,超聲處理(功率500 W,頻率40 kHz) 30 min,放冷,加50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。
2.4 測(cè)定法
分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL,注入高效液相色譜儀,測(cè)定,即得。
2.5 專屬性考察
2.5.1 陰性對(duì)照溶液的制備:按處方比例稱取除金銀花、野菊花以外的其余藥味,按制備工藝制成缺金銀花、野菊花的陰性樣品,按上述供試品制備方法制成缺金銀花、野菊花的陰性對(duì)照溶液。
2.5.2 陰性對(duì)照試驗(yàn):按上述色譜條件,取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液,各進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明,在綠原酸相同保留時(shí)間處,供試品有色譜峰出現(xiàn),陰性樣品無(wú)色譜峰出現(xiàn),比較色譜圖可知方法專屬性較好,表明陰性樣品無(wú)干擾。
圖1 高效液相色譜圖
2.6 線性關(guān)系考察
分別精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液4、8、12、16、20μL注入高效液相色譜儀,測(cè)定峰面積。以峰面積積分值(Y)對(duì)對(duì)照品的質(zhì)量(X)進(jìn)行線性回歸,得出回歸方程以及線性范圍。Y= 1.58×103X+2.43,r=0.9999。表明綠原酸進(jìn)樣量在線性范圍0.04036~0.2018 mg范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣量呈良好線性關(guān)系。
2.7 精密度試驗(yàn)
在上述色譜條件下,精密進(jìn)樣同一綠原酸對(duì)照品溶液10 μL,連續(xù)測(cè)定6次,記錄峰面積,計(jì)算RSD為0.42%,表明該方法精密度良好。
2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取樣品(批號(hào):20130301)新配的供試品溶液,分別在0、4、8、12、16、20、24 h時(shí)進(jìn)樣10 μL,測(cè)定綠原酸的峰面積,計(jì)算RSD為0.45%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.9 重現(xiàn)性試驗(yàn)
取同一批號(hào)的樣品(批號(hào):20130301)6份,按2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液,每份樣品精密吸取10 μL,按上述色譜條件,分別測(cè)定,記錄峰面積,計(jì)算RSD為0.80%,表明該方法重現(xiàn)性良好。
2.10 加樣回收率試驗(yàn)
精密稱取已知含量樣品(批號(hào):20130301)約1g,共9份,精密加入綠原酸對(duì)照品儲(chǔ)備液(0.2018 g/L)0.5、0.5、0.5、0.6、0.6、0.6、0.7、0.7、0.7 mL,然后按2.3項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液,并按2.4項(xiàng)下測(cè)定法進(jìn)行綠原酸含量檢測(cè),結(jié)果加樣回收率為99.3%~101.1%,計(jì)算RSD為1.43%,表明加樣回收率符合要求。
2.11 樣品測(cè)定
按正文含量測(cè)定方法對(duì)金菊利咽顆粒三批樣品進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 三批樣品綠原酸含量測(cè)定結(jié)果表
根據(jù)上述測(cè)定結(jié)果,結(jié)合考慮金銀花藥材中綠原酸的含量,暫定本品每袋含金銀花以綠原酸(C16H18O9)計(jì),不得少于13 mg。
采用高效液相色譜法測(cè)定綠原酸含量作為定量控制的指標(biāo),該方法操作簡(jiǎn)便,結(jié)果準(zhǔn)確,靈敏度高,重現(xiàn)性好,方法學(xué)考察表明該方法準(zhǔn)確可靠,可有效控制金菊利咽顆粒的質(zhì)量。
綠原酸為咖啡酸奎尼酸酯,因而既能被酸也能被堿催化水解。陳鋼等[6]研究表明,其水溶液在pH 3.0時(shí)最穩(wěn)定。顧利紅[7]研究日光和溫度對(duì)綠原酸穩(wěn)定性影響發(fā)現(xiàn),綠原酸對(duì)照品置棕色量瓶中,在冰箱(2 ℃)保存16 d,基本穩(wěn)定。在無(wú)色量瓶中,室溫(25~30 ℃)放置時(shí)最不穩(wěn)定,易分解,隨著放置時(shí)間的增加,綠原酸濃度不斷降低。在本研究中采用測(cè)定綠原酸的含量為定量指標(biāo),結(jié)果表明其含量穩(wěn)定,回收率高,重現(xiàn)性好,可有效的控制金菊利咽顆粒的質(zhì)量。
[1] 袁學(xué)勤,遲靜波,胥云.HΡLC測(cè)定野菊花中綠原酸的含量[J].中成藥,2005,27(4):493-494.
[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:1084.
[3] 劉愛(ài)學(xué),陳翠花,郭耀武.消癌平片中綠原酸的HΡLC法測(cè)定[J].西北藥學(xué)雜志,2005,20(2):56-57.
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[5] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:205.
[6] 陳鋼,侯世祥,胡平等.金銀花提取物中綠原酸的穩(wěn)定性研究[J].中國(guó)中藥雜志,2003,28(3):223-225.
[7] 顧利紅,朱品業(yè).日光和溫度對(duì)綠原酸供試液穩(wěn)定性的影響[J].中成藥,1999,21(11):16-17.
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1671-8194(2014)10-0061-02