劉揚(yáng)，冀軍，包烏仁吐亞，楊帆，吳海榮

（1.包頭醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，內(nèi)蒙古包頭014060；2.包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古包頭014010）

載脂蛋白（apolipoprotein，Apo）是脂蛋白的重要組分，僅在肝、腸細(xì)胞中特異表達(dá)，可能與DNA甲基化作用相關(guān)，在已知基因中，ApoB基因具有最明顯的多態(tài)性。本研究選擇XbaⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)對(duì)內(nèi)蒙古中西部地區(qū)的漢族和蒙古族兩個(gè)群體的遺傳多態(tài)性進(jìn)行調(diào)查。

ApoB參與體內(nèi)的脂質(zhì)代謝，為乳糜微粒與低密度脂蛋白（LDL）的主要蛋白質(zhì)成分。XbaⅠ酶切位點(diǎn)多態(tài)性是第26個(gè)外顯子上2488密碼子ACC→ACT變異，產(chǎn)生了1個(gè)XbaⅠ酶切點(diǎn)，即X+等位基因，但未改變氨基酸序列屬靜息突變，不直接影響ApoB基因水平；無酶切位點(diǎn)的稱X-等位基因。

EcoRⅠ酶切位點(diǎn)位于ApoB基因的第29外顯子，由于4154位密碼子的第1個(gè)堿基G→A突變，使GAA→AAA，原有的EcoRⅠ酶切位點(diǎn)消失，產(chǎn)生E-等位基因，如不發(fā)生突變則為E+等位基因。

1 材料與方法

1.1 樣本

120例漢族無關(guān)個(gè)體選自包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院體檢人群，100例蒙古族無關(guān)個(gè)體選自自愿獻(xiàn)血人群及包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院體檢人群。常規(guī)酚-氯仿法提取基因組DNA。

1.2 引物合成與純化

PCR引物XbaⅠ上游引物：5′-GGAGACTATTCA GAAGCTAA-3′；下游引物：5′-GAAGAGCCTGAAGA CTGACT-3′。EcoRⅠ上游引物：5′-CTGAGAGAAGTG TCTTCGAAG-3′；下游引物：5′-CTCGAAAGGAAGTGTAATCAC-3′。

1.3 PCR反應(yīng)體系

20 μL的總反應(yīng)體系中含：DNA模板2.0 μL，Primer1 0.5μL，Primer2 0.5μL，LA Taq DNA聚合酶0.1 μL，4×dNTP 1.5 μL，10×buffer 2.0 μL，滅菌雙蒸水加至20μL。

1.4 PCR反應(yīng)條件

兩個(gè)位點(diǎn)復(fù)合擴(kuò)增。95℃5 min；94.5℃1min，58℃1min，72℃1.5min，72℃7min，30個(gè)循環(huán)。

1.5 PCR產(chǎn)物鑒定

取基因PCR產(chǎn)物5 μL置于1%瓊脂糖凝膠（含1/10000 DNA熒光染料）上電泳30min（電壓100V），紫外燈下觀察結(jié)果，拍照記錄。

1.6 PCR產(chǎn)物結(jié)果判斷

所用引物擴(kuò)增出的ApoB基因PCR產(chǎn)物為710bp和480 bp，對(duì)已擴(kuò)增出的ApoB基因產(chǎn)物再分別用XbaⅠ和EcoRⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，進(jìn)一步鑒定其等位基因型。

1.7 限制性片段長度多態(tài)性分析

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL，加內(nèi)切酶0.25 μL，酶切緩沖液1μL，BSA 0.1μL，再加雙蒸水至總體積10μL于37℃消化4h，然后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100V，電泳時(shí)間40min，紫外燈下觀察并于凝膠成像系統(tǒng)攝影記錄。

ApoB基因有一個(gè)XbaⅠ酶切位點(diǎn)，切除片段大小分別為433bp（X+）和277bp（X+）為稀有基因，未切開片段710bp（X-）為常見片段；ApoB基因另一個(gè)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，切除片段分別為253bp（E+）和227bp（E+）為常見片段，未切開的片段480bp（E-）為稀有基因。

用文獻(xiàn)[1]介紹的方法計(jì)算雜合度（H）、個(gè)體識(shí)別率（DP）和非父排除率（PE）等群體遺傳學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

本研究共調(diào)查了內(nèi)蒙古中西部地區(qū)漢族120名和蒙古族100名個(gè)體的ApoB基因XbaⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性。將調(diào)查所得的XbaⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)在兩個(gè)群體中分布頻率的數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，結(jié)果均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05）。同時(shí)，根據(jù)本研究所得到的漢族群體在內(nèi)蒙古中西部地區(qū)ApoB基因XbaⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率（表1），計(jì)算得出H、DP、PE在XbaⅠ為0.0400、0.0768、0.0192，在EcoRⅠ為0.0800、0.1534、0.0420。

表1 ApoB基因XbaⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)在內(nèi)蒙古中西部漢族群體中的多態(tài)性分布

對(duì)內(nèi)蒙古中西部地區(qū)ApoB基因XbaⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率的調(diào)查結(jié)果顯示，漢族群體中同時(shí)檢測出了稀有基因X+和E-，而在蒙古族群體中沒有檢測出此兩種稀有等位基因。將本研究結(jié)果與其他種族和地區(qū)人群數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。

表2 ApoB基因XbaⅠ位點(diǎn)基因型頻率在不同群體中的比較

如表2所示，在不同的群體中X+等位基因頻率不同，在東亞地區(qū)是最低的，如內(nèi)蒙古人群、北京漢族人、上海漢族人、日本人、新加坡漢族人和新加坡印度人，但是在西歐人群中X+等位基因頻率較高，如芬蘭人、法國人、歐美白人。文獻(xiàn)報(bào)道，新加坡漢族人EcoRⅠ位點(diǎn)的等位基因（E-）頻率為0.07[6]，昆明漢族人為0.02[5]，國內(nèi)葉平等[11]報(bào)道為0.05，與本研究結(jié)果相似。上述結(jié)果顯示，雖然ApoB基因XbaⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)在法醫(yī)學(xué)中的效能不高，但是等位基因頻率分布在不同種族中差異較大，可能與人類種族進(jìn)化過程中遺傳漂變或自然選擇有關(guān)，因此ApoB基因XbaⅠ和EcoRⅠ位點(diǎn)具有種族鑒定的應(yīng)用可能。

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