張 昱， 孟 昱， 張 鋼， 封新國， 徐成立， 李云飛

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河北 保定 071001； 2.河北省林業(yè)廳，河北 石家莊 050000；3.河北省木蘭圍場國有林場管理局，河北 承德 068450)

菌根冬季抗寒性的信息對森林苗圃培育有非常實用的價值，如果冬季雪覆蓋變淺，或秋季苗木移至冷庫時間太早，根系和菌根受到霜凍脅迫，將會降低苗木活力.隨著全球氣候變暖，北方林區(qū)冬季溫度升高，在溫暖條件下，土壤結(jié)凍-解凍循環(huán)的頻率加大，雪的融化和降雨的增加，對樹木根系和菌根產(chǎn)生一定的影響.中國北方地區(qū)，春季樹木脫鍛煉抗寒性下降期間，每日溫度常發(fā)生很大波動；晴天晝夜溫度變化劇烈，對植物生長危害極大.如果受到低溫侵襲，樹木尤其是苗木即會遭受寒害.因此，樹木必須有足夠的抵御低溫和抵抗脫水的能力才能減輕寒害.研究表明，一些樹種的脫鍛煉過程可能是可逆的，即在溫暖氣候條件下脫鍛煉一段時間后，如遇寒冷天氣，抗寒性可能會恢復(fù)[1,2].前人對接種外生菌根對林木幼苗共生關(guān)系及抗寒性進(jìn)行了研究[3,4]，但對脫鍛煉及再鍛煉過程中，北方樹木接種外生菌根對苗木抗寒性的作用研究很少；在前人對電阻抗的研究中，只單純對植物進(jìn)行電阻抗的測定和分析，沒有考慮微生物的影響.本研究對經(jīng)過2種真菌侵染處理的油松(Pinustabulifomis)幼苗春季脫鍛煉結(jié)束后，再以低溫處理一段時間后對它們的生長情況及抗寒能力的恢復(fù)情況進(jìn)行了研究，旨在研究真菌侵染油松幼苗再鍛煉期間與無真菌侵染的幼苗的生長及抗寒性差異，探究真菌侵染對油松幼苗的作用，為脫鍛煉期間提高幼苗生長量和增強抗寒性提供理論依據(jù)和實踐借鑒.

1 材料與方法

1．1試驗材料

以中國林業(yè)科學(xué)研究院購買的土生空團(tuán)菌(CenococcumgeophilumFr.)和紅蠟?zāi)?Laccarialaccata(Scop. : Fr.) Berk. et Br.)作為測試菌種；以河北承德圍場種苗站提供油松(Pinustabulaeformis) 種子 (發(fā)芽率95%)為試驗材料進(jìn)行抗寒性測試分析.

1．2試驗方法

1．2．1 菌絲體純化培養(yǎng) 將買來的新鮮馬鈴薯洗凈去皮(已發(fā)芽的要挖掉芽眼)，稱取400 g切成薄片，置于鋁鍋加水煮沸30 min，用4層紗布過濾取汁，補足水分到1 000 mL；瓊脂20 g加入馬鈴薯汁液內(nèi)，微火加熱，不時攪拌直至瓊脂全部溶化，再加入葡萄糖20 g，加熱幾分鐘，使其完全溶解.最后，將配好的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基置于121.6 ℃高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌30 min.在超凈工作臺內(nèi)把培養(yǎng)基灌于平板內(nèi)，冷卻后將生長健壯的菌種接于其中，用封口膠封好，放入25 ℃ 的暗培養(yǎng)室培養(yǎng)，每7 d擴繁1次，擴繁不超過30 d.

1．2．2 油松幼苗培養(yǎng)

1．2．2．1 油松種子催芽 采用低溫層積催芽.在播種前60～90 d，將種子用 0.5%高錳酸鉀溶液消毒后，以50～60 ℃的溫水浸種24 h，混以2～3倍消過毒的潔凈濕沙，置于3～4 ℃恒溫人工氣候室內(nèi)層積.播種前除去沙粒，取出種子，用去離子水漂洗數(shù)次后置于培養(yǎng)皿中備用.

1．2．2．2 油松幼苗培養(yǎng)基的制備 將5 L蛭石和1 L PDA液體培養(yǎng)基(無瓊脂)混合，含水量以手握成團(tuán)不滴水一觸即散為宜.將混合均勻的基質(zhì)裝入規(guī)格為直徑18 mm、長180 mm的試管的1/2處，塞緊棉塞用牛皮紙封口，置于121.6 ℃高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌2 h.之后在超凈工作臺上，將鑷子灼燒滅菌冷卻后，取原培養(yǎng)基邊緣的新菌0.5 cm2，接種于滅菌后的蛭石-PDA混合基質(zhì)中，并置于25～26.5 ℃恒溫避光的人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)備用.

1．2．2．3 播種 在超凈工作臺上，將層積處理并滅菌后的油松種子播種到接有土生空團(tuán)菌和紅蠟?zāi)⑶疑L良好的基質(zhì)試管中，并且播種于一部分與無接種真菌的試管中作為對照.種子播在試管中央，每個試管內(nèi)播2粒，然后覆蓋滅過菌的濕沙，厚度為0.5～1 cm.塞緊棉塞用牛皮紙封口后，繼續(xù)置于20～25 ℃恒溫人工氣候室內(nèi)育苗，約30 d待出苗后種殼剛脫落時使用.

1．2．2．4 菌根侵染及生長指標(biāo)的測定 菌根侵染率測定[6]：外生菌根感染率的計測采用統(tǒng)計計算法.將根樣剪成1cm等長的根段，隨機選取根樣，每樣60個根段.菌根感染率(%)=(感染菌根根段數(shù)/總根段數(shù))×100%.油松幼苗的生長測定：幼苗生長期間，進(jìn)行2次株高和地徑(距地面1 cm)的測定.每次每個處理選擇8株標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行測定，3次重復(fù).并用直尺測量地上和地下部分的長度，計算根冠比.干物質(zhì)含量測定：每個處理分根、莖、葉，每次稱鮮質(zhì)量約為1 g.將稱量的樣品進(jìn)行密封，放入干燥箱，烘干48 h，取出稱干質(zhì)量，按照干質(zhì)量/鮮質(zhì)量計算干物質(zhì)含量.3次重復(fù).

1．2．2．5 油松幼苗的再鍛煉處理 03-18將幼苗放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)箱設(shè)置的溫度及光照分別為白天和夜晚10 ℃和6 ℃、光周期為14 h/10 h(光照/黑暗).濕度均為60%,光照強度為80%.03-17進(jìn)行第1次各種指標(biāo)的測試，之后將原設(shè)定溫度由15～20 ℃降至6～10 ℃，使油松幼苗經(jīng)過1次再鍛煉的低溫處理.處理時間為03-18—03-27，歷時10 d.

1．2．3 電導(dǎo)法(EL)和電阻抗圖譜法(EIS)測定抗寒性

1．2．3．1 冷凍處理 將幼苗用自來水沖洗幾次，去除表面污染物，再用去離子水沖洗3次，用干凈紗布輕輕吸干幼苗表面水分，之后裝入塑封袋，噴少許去離子水，防止材料發(fā)生過冷現(xiàn)象.放入冰箱中進(jìn)行冷凍處理，設(shè)置7個溫度，見表1，其中以4 ℃為對照.到達(dá)每個設(shè)定溫度后，保持4 h，再取出放入4 ℃冷藏室緩慢解凍24 h.冷凍溫度的范圍因植物發(fā)育階段的不同而不同，發(fā)育階段的差異性直接影響植物的抗寒性.

表1 2次冷凍處理測定抗寒性所設(shè)置溫度

1．2．3．2 相對電導(dǎo)率的測定 采用電導(dǎo)法(EL法)進(jìn)行抗寒性測定[7].緩慢解凍后，每個幼苗根、莖葉分別切取10 mm，縱切成4份，每個溫度梯度設(shè)定4次重復(fù).待混合均勻后，每個試管中放4個切好的小莖段.每個試管中加11 mL去離子水，保鮮膜封口，放入搖床中振蕩24 h.用DDSL-308型電導(dǎo)儀(上海京科雷磁)測滲出液的初電導(dǎo)值(C1).保鮮膜封口后將試管置于沸水中煮沸20 min；再放入搖床中振蕩24 h，測終電導(dǎo)值(C2).每次測定，去離子水作對照，測定空白電導(dǎo)值.用如下公式計算相對電導(dǎo)率(REL)：

REL(%)=[(C1-C空白1)/(C2-C空白2)]×100%.

1．2．3．3 EIS參數(shù)的測定 參考ZHANG等[8]的方法進(jìn)行EIS參數(shù)測定.緩慢解凍后，從每個處理中隨機選取8株幼苗，根、莖、葉分別切取15 mm進(jìn)行電阻抗測定.用測厚儀(Mitutoyo No.7331，Japan)測定厚度，精確到0.01 mm.試驗采用Ag/AgCl電極，在電極上加電極凝膠，使莖段樣本的橫切面與凝膠接觸.對阻抗儀(HP4284A，USA)進(jìn)行開路和短路校正.校正后，測定從80～1 000 MHz共42個頻率下的電阻值和電抗值.將上述各頻率所得數(shù)值作為實部和虛部，做出隨頻率變化電阻和電抗的變化曲線，即EIS.等效電路參數(shù)采用ZARC模型，LEVM8.06 (MacdonaldJR)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，得出模型參數(shù).

1．2．3．4 EL法和EIS法求抗寒性 相對電導(dǎo)率或電阻抗參數(shù)胞外電阻率re的變化與抗寒性的關(guān)系可用Logistic 方程表示，應(yīng)用SPSS 17.0軟件，通過計算方程的拐點溫度表示組織半致死溫度(LT50)，估算抗寒性[7].

1．3統(tǒng)計分析

利用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和作圖，應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析[10].

2 結(jié)果與分析

2．1接種對油松幼苗菌根感染率的影響

菌根侵染率測定表明，接種不同外生菌根真菌苗木菌根感染率不同.接種土生空團(tuán)菌的油松幼苗的感染率為73%，接種紅蠟?zāi)⒌挠退捎酌绺腥韭蕿?2.2%，對照油松幼苗未發(fā)生感染.

2．2接種對油松幼苗生長的影響

在對種子植入2種真菌后發(fā)現(xiàn)，3種處理在試驗條件一致的情況下，種子發(fā)芽時間均在播種3 d后.土生空團(tuán)菌、紅蠟?zāi)?、對照苗的出苗率分別為92.1%、90%和93.2%，表明菌根真菌對種子的出苗時間及出苗率影響不明顯.出苗率與對照苗相比差別不大，對后期幼苗生長影響也不大，說明土生空團(tuán)菌和紅蠟?zāi)τ退捎酌绺呱L促進(jìn)作用不明顯.但是土生空團(tuán)菌對油松幼苗地徑、根冠比的影響較紅蠟?zāi)⒑蛯φ彰缑黠@(P<0.05)：土生空團(tuán)菌對油松幼苗地徑及地下生物量的促進(jìn)作用顯著(表2).

表2 土生空團(tuán)菌和紅蠟?zāi)τ退捎酌缟L指標(biāo)的影響

2．3再鍛煉期間油松幼苗的抗寒性

2．3．1 油松幼苗抗寒性變化 用傳統(tǒng)的電導(dǎo)法測定抗寒性的結(jié)果顯示，再鍛煉前后，真菌苗的抗寒性均比對照苗的抗寒性顯著增強，其中土生空團(tuán)菌苗的根、莖和針葉的抗寒性最強，與對照苗的抗寒性差異顯著(P<0.05)(紅蠟?zāi)⒄婢绲母购猿?見(圖1、2).3種處理的幼苗之間抗寒性差異顯著，可能是由于真菌與幼苗侵染而產(chǎn)生的幼苗生長差異及生理生化差異導(dǎo)致的.

隨著再鍛煉的進(jìn)行，真菌苗和對照苗的抗寒性都明顯增強(圖2).抗寒性提高的速率表現(xiàn)出一定程度的差異.再鍛煉后，土生空團(tuán)菌苗的根、莖和針葉的抗寒性比再鍛煉前分別提高了4～8 ℃；紅蠟?zāi)⒄婢绲母?、莖和針葉的抗寒性分別提高了4～6 ℃；對照苗的根、莖和針葉的抗寒性分別提高了約4～6 ℃.

綜合再鍛煉前后抗寒性的測定結(jié)果可以看出，接入土生空團(tuán)菌的油松幼苗抗寒性最強，抗寒能力強弱排序依次為：土生空團(tuán)菌>紅蠟?zāi)?對照.再鍛煉前后，真菌侵染苗及對照苗不同器官的抗寒性的強弱為根>莖或針葉(圖1、圖2).

注：Cg真菌指土生空團(tuán)菌，H真菌指紅蠟?zāi)?

圖2 再鍛煉后(03-31)真菌侵染苗與對照苗不同器官的LT50溫度比較圖

2．3．2 EIS法與EL法測定抗寒性比較 用EIS法和EL法測得的植物抗寒性略有差別，但差異不顯著.選擇數(shù)據(jù)差異較明顯的莖作為抗寒性對比.整體來看由EIS法的胞外電阻率re計算的抗寒性與EL法計算的抗寒性相關(guān)性最高，雖然比EL法計算的抗寒性要低，但二者測定的抗寒性的差異不顯著(圖3).回歸方程為y=-0.388 6x2-8.793 9x-57.85(R2=0.78).

圖3 EIS法的胞外電阻率re求出的抗寒性與EL法求出的抗寒性的相關(guān)性

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，接種了土生空團(tuán)菌的油松幼苗比接種紅蠟?zāi)⒑蛯φ沼酌缣岣吡说貜?、根冠比，而紅蠟?zāi)⒄婢鷮τ退捎酌绲纳L作用影響不顯著，表明不同真菌對油松幼苗生長的作用是不一樣的.在接種真菌時要針對性地選擇真菌品種.林業(yè)中衡量苗木質(zhì)量的一個重要指標(biāo)就是根冠比，土生空團(tuán)菌苗的根冠比顯著高于對照，這對增強苗木抗逆性有利.

研究表明，接種過真菌和未接種過真菌的幼苗的抗寒性存在差異，真菌侵染增強苗木的抗寒性.研究結(jié)果與趙平娟等[8]的研究結(jié)果基本一致，但是在菌株的選擇上有很大不同，具體區(qū)別如下：本研究的試驗對象是被真菌侵染的油松幼苗，而影響抗寒性的因素不單純是植物自身因素，還包括真菌侵染后對幼苗抗寒性的影響，因此，才會出現(xiàn)2種真菌入侵油松幼苗后，產(chǎn)生抗寒性強弱的差異；此外，由于真菌在生長過程中，侵染了油松幼苗根部的皮層處，與植物形成了共生關(guān)系，真菌形成了類似“根毛”的團(tuán)狀物，增加了植物吸收養(yǎng)分和水分的能力，從而提高了植物自身的抗性，以及轉(zhuǎn)換淀粉和糖的能力，致使接種菌根的幼苗與對照幼苗的抗寒性產(chǎn)生差異.本研究發(fā)現(xiàn)：(1)真菌侵染根的抗寒性較莖、針葉的抗寒性強.真菌侵染主要作用于根系，而根系抗寒性的增強對苗株整體抗寒性的增強起重要作用.即一般來說，根系抗寒性高，植株抵御低溫脅迫的能力更強.(2)再鍛煉后的抗寒性較再鍛煉前的顯著提高.再鍛煉后，土生空團(tuán)菌侵染苗的抗寒性較對照苗有顯著提高，根提高了約3.02 ℃，莖約4.13 ℃，針葉為4.08 ℃；紅蠟?zāi)⑶秩久绺?、莖、針葉的抗寒性較對照苗分別提高約2.5 ℃,3.25 ℃和3.01 ℃，也比對照苗的有一定幅度的增大.但土生空團(tuán)菌侵染苗的針葉以及紅蠟?zāi)⑶秩久绲母目购蕴岣叩姆扰c對照無差異.看來不同真菌侵染對不同器官的作用是不一樣的.植物通過真菌侵染和再鍛煉使抗寒性增強幅度明顯提高，植物對春節(jié)霜凍的抵御能力會更強.在生產(chǎn)上，在脫鍛煉期間可通過這2種手段，幫助植物抵御春季低溫脅迫.本研究顯示，油松幼苗接種土生空團(tuán)菌效果更佳.

本研究以EL法為標(biāo)準(zhǔn)，評價EIS法在油松幼苗抗寒性研究中的應(yīng)用.研究發(fā)現(xiàn)，在EIS法中，胞外電阻率re求出的抗寒性與EL法存在相關(guān)性，與ZHANG等[9,10]、REPO等[11]和AZZARELLO等[12]用EIS法和EL法測定歐洲赤松(Pinussylvestris)、白皮松(Pinusbungeana)和油橄欖(Oleaeuropaea)的抗寒性結(jié)果相似.前人在對歐洲赤松抗寒性研究發(fā)現(xiàn)，在抗寒性較弱的時候，用EIS法和EL法測定的抗寒性值相差較小，而在抗寒性較強時期，2種方法測得的抗寒性差異較大[11]，在本試驗中，通過對油松幼苗電阻抗的測定表明，雖然不同樹種之間存在差異，但是EIS法和EL法2者估測抗寒性均存在明顯相關(guān)性，EIS法可以用來估測油松幼苗的抗寒性，且re是植物冷凍處理后測定其抗寒性的最佳參數(shù).

參考文獻(xiàn)：

[1]張 潔,張 鋼,李金花.等.電導(dǎo)法和電阻抗圖譜法測定脫鍛煉期間歐美楊與大青楊雜交F1子代抗寒性[J].植物生理學(xué)通訊,2012(1):44-50.

[2]張 鋼, 劉 民, 任元新. 春季白皮松實生苗的脫鍛煉與再鍛煉[J]. 植物生理學(xué)通訊, 2005, 41(6): 761-763.

[3]李桂蘭,麻德業(yè).白樺幼苗外生菌根的初步研究[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2002,22(2):127-128

[4]楊艷敏. 外生菌根真菌與桉樹耐寒性的相關(guān)性研究[D].桂林： 廣西大學(xué)，2007.

[5]寶秋利, 閆 尾, 梁顯麗. 土生空團(tuán)菌(CenococcumgeophilumFr.)菌絲體純培養(yǎng)條件的初步研究[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2005(1): 33-36.

[6]宋瑞清 吳 克.紅皮云杉外生菌根菌對苗木生長的影響 [J]. 微生物學(xué)報, 2005,45(06):910-914.

[7]李亞青,張 鋼,卻書鵬.等.白皮松莖和針葉的電阻抗參數(shù)與抗寒性的相關(guān)性[J].林業(yè)科學(xué),2008,44(4):28-34.

[8]趙平娟. 菌根真菌提高植物抗逆性的研究[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué), 2004

[9]ZHANG G, LI Y Q, DONG S H. Assessing frost hardiness of Pinus bungeana shoots and needles by electrical impedance spectroscopy with and without freezing tests [J]. Journal of Plant Ecology, 2010, 3(4): 285-293.

[10]REPO T, LAPPI J. Estimation of standard error of impedance-estimated frost resistance[J]. Scandinavian Journal of Forest Research, 1989, 4: 67-74.

[11]REPO T, ZHANG G , RYYPPO A ,RIKALA R. The electrical impedance spectroscopy of Scots pine (PinussylvestrisL.) shoots in relation to cold acclimation [J]. Journal of experimental botany, 2000, 51(353): 2095-2107

[12]AZZARELLO,SERGIO,CAMILLA,et al. Comparing image (fractal analysis) and electrochemical (impedance spectroscopy and electrolyte leakage) techniques for the assessment of the freezing tolerance in olive [J]. Trees-Structure and Function, 2009, 23(1): 159-167.