張雖栓，李延磊，高誠偉

(1.河南質(zhì)量工程職業(yè)學(xué)院，河南 平頂山 467000； 2.云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院,云南 昆明 650091)

褶菌多糖(Schizophyllan)是菌體經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)的中性胞外多糖.裂褶菌多糖的結(jié)構(gòu)與分子量的高低與裂褶菌菌種的選擇、培養(yǎng)和發(fā)酵條件的有關(guān)，而多糖的分子量又直接影響了多糖的生物學(xué)活性和開發(fā)前景，在調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤、抗輻射等方面有顯著的療效[1、2]，特別是相對分子量在450kD以上的多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用最為廣泛，需求量最大[3、4].目前，對裂褶菌多糖提取工藝的研究主要有酸提取法、熱水浸提法和稀堿提取法等[5～8].微波輻射輔助提取法具有選擇性高、提取時(shí)間短、提取率高等優(yōu)點(diǎn).本研究將微波技術(shù)用于高分子量裂褶菌多糖的提取，組合提取工藝，以期達(dá)到提高提取率、減少能耗的目的.

1 材料與方法

1.1材料與試劑

裂褶菌(SchizophyllumcommuneFr.)種由昆明云覃科技開發(fā)有限公司提供.

1.2儀器與設(shè)備

普通恒溫?fù)u床,中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；HZQ-F280全溫度振蕩培養(yǎng)箱，太倉市華美生化儀器廠；UV-2102PC紫外可見分光光度計(jì)，德國Bruker公司；2K-82A型真空干燥箱，上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠； 320-S型pH計(jì)，METTLER TOLED; AEl00S電子分析天平; Galanz WD700ATL17-3電腦型燒烤微波爐(功率計(jì)為700 W).

1.3試驗(yàn)方法

1. 3.1 培養(yǎng)條件 菌種采用PDA固體培養(yǎng)基，將菌種接種到試管斜面培養(yǎng)基上，于室溫靜置活化3 d，活化好的斜面菌種接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的三角瓶中27 ℃下培養(yǎng)2 d，得到液體菌種；接著將菌種接種到固體培養(yǎng)基27 ℃下培養(yǎng)7～8 d，至菌絲體充滿整個(gè)培養(yǎng)基，結(jié)束發(fā)酵過程[9、10].

1.3.2 純度鑒定

1.3.2.1 凝膠柱層析 將Sephadex G-100裝于1.6 cm×20 cm玻璃旋塞柱并平衡，SPG上樣量1 mg，用雙蒸水洗脫，每管收集3 mL，流速0.5 mL·min-1.采用硫酸-苯酚法[11]在490 nm處隔管檢測OD值.

1.3.4 微波提取裂褶菌多糖的提取工藝流程 斜面種子培養(yǎng)—液體菌種接種—固體發(fā)酵培養(yǎng)—干燥—粉碎—微波提取—乙醇沉淀—粗裂褶菌胞外多糖含量測定—粗多糖純化(脫色、脫蛋白)—成品.

1.3.5 裂褶菌多糖得率的測定 裂褶菌多糖含量的測定采用水浸-醇沉法提取測定法，經(jīng)適當(dāng)稀釋后用苯酚-硫酸法測定溶液中多糖含量.裂褶菌多糖提取率計(jì)算公式[12]為：

多糖提取率=所得溶液中粗糖含量(mg/mL)×多糖溶液體積(mL)×釋釋倍數(shù)×換算因子/原材料質(zhì)量(mg)×100%

1.4裂褶菌多糖微波提取工藝優(yōu)化

1.4.1 單因素試驗(yàn) 選取微波強(qiáng)度、提取溫度、料液比、提取時(shí)間4個(gè)因素作單因素試驗(yàn)[13].取一定量粉碎的裂褶菌干體，利用微波在微波強(qiáng)度為450～650 W之間，加入料液比(質(zhì)量與體積比)1∶10～1∶35 g·mL-1的蒸餾水， 10～60 ℃的溫度下對裂褶菌多糖進(jìn)行了5～30 min進(jìn)行提取，探討其對裂褶菌多糖提取率的影響.

1.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取條件 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定了最佳條件后，以Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)計(jì)了4因素5水平組合試驗(yàn)優(yōu)化裂褶菌多糖的提取工藝[14].

表1 響應(yīng)面分析因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1微波提取裂褶菌多糖工藝的優(yōu)化

2.1.1 微波強(qiáng)度對裂褶菌多糖提取率的影響 微波強(qiáng)度對裂褶菌多糖提取率的影響見圖1.從圖1可以看出，在提取時(shí)問為30 min，液料比為1∶30 g·mL-1，提取溫度為50 ℃的條件下,隨著微波功率的逐漸提高，裂褶菌多糖提取率不斷增加[15].當(dāng)微波功率達(dá)到550 W時(shí)，達(dá)最大值.再隨功率的增加，多糖提取率變化不明顯，所以選取550 W為最佳功率.

2.1.2 微波提取時(shí)間對裂褶菌多糖提取率的影響 提取時(shí)間對裂褶菌多糖提取率的影響見圖2.由圖2可知，在10～20 min裂褶菌多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加的最快， 在20 min以后裂褶菌多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所增加，但趨勢很慢.根據(jù)提取理論可知，提取時(shí)間延長有利于提取得率的提高，但是要考慮實(shí)際因素，使成本最低時(shí)相對得率最大.綜合提取過程中的每個(gè)因素，從節(jié)約能源，降低成本考慮20 min為最佳提取時(shí)間.由圖2可知，隨著微波提取時(shí)間的增加，裂褶菌多糖的提取率呈上升趨勢.當(dāng)時(shí)間達(dá)到20 min時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大，所以選取20 min為佳.

圖1 微波強(qiáng)度對裂褶菌多糖提取率的影響

圖2 提取時(shí)間對裂褶菌多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.1.3 不同料液比對裂褶菌多糖提取率的影響 不同料液比對裂褶菌多糖提取率的影響見圖3.由圖3可知，多糖提取率隨料液比增加而上升.經(jīng)分析料液比從1∶6 g·mL-1增加到1∶30 g·mL-1多糖提取率顯著上升，而料液比增加到1∶30 g·mL-1以后提取率變化增加不明顯，所以1∶30 g·mL-1為適宜提取料液比.

圖3 不同料液比對裂褶菌多糖提取率的影響

2.1.4 提取溫度對裂褶菌多糖提取率的影響 提取溫度對裂褶菌多糖提取率的影響見圖4.由圖4可知，裂褶菌多糖的提取率隨著溫度的升高在逐漸的提高，溫度在10～50 ℃時(shí)，裂褶菌多糖的提取率增加最快，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，裂褶菌多糖達(dá)到最大，60 ℃時(shí)，裂褶菌多糖的提取率則降低，可能是裂褶菌多糖在高溫下會發(fā)生裂解，導(dǎo)致它的生物活性降低.綜合整個(gè)過程，從節(jié)約能源、降低成本、縮短生產(chǎn)時(shí)間考慮，故選擇50 ℃為最佳提取溫度.

圖4 提取溫度對裂褶菌多糖提取率的影響

2.2響應(yīng)面法優(yōu)化裂褶菌多糖的提取工藝

2.2.1 分析因素的選取 根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[17～19]，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以裂褶菌多糖的提取率(Y)做4因素5水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素及水平設(shè)計(jì)如表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2.

表2 響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析結(jié)果

續(xù)表 Continuing table

2.2.2 模型的建立及其顯著性檢驗(yàn)

2.2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素的基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design-Expert 7.0軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，，用二次回歸旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法，綜合考慮各個(gè)因素對裂褶菌胞外多糖得率的影響，進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程：

Y=1.89+0.033 1X1+0.013 8X2+0.010 1X3+0.036 5X4-0.074 2X12-0.029 2X22-0.079 6X32-0.055 3X42-0.047 2X1X2+0.005 4X1X3-0.049 7X1X4-0.016 4X2X3-0.018 2X2X4-0.001 0X3X4.

2.2.2.2 二次回歸模型的顯著性檢驗(yàn) 對上述回歸模型進(jìn)行方差分析結(jié)果表明(表3)，該模型P值小于0.000 1，失擬項(xiàng)P=0.088不顯著，表明該模型擬合結(jié)果好.由表4可知，除料液比顯著影響(P=0.004)，微波強(qiáng)度(P=0.003 8)具有顯著影響外，其他因素如二次項(xiàng)和交互項(xiàng)對裂褶菌多糖的提取率都有極顯著的影響，數(shù)據(jù)表明具體試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系.各個(gè)因素對裂褶菌多糖提取率的影響程度大小順序?yàn)椋毫弦罕?X2)>微波強(qiáng)度(X4)>提取時(shí)間(X1)>提取溫度(X3).由相關(guān)系數(shù)R=0.907，表明該數(shù)學(xué)模型4個(gè)因素對產(chǎn)量的影響占90.7%，而其它因素的影響和誤差占9.3%.

表3 回歸模型方差分析

表4 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

2.2.2.3 最佳提取裂褶菌胞外多糖方案 利用回歸方程分別對X1，X2，X3，X4求偏階導(dǎo)數(shù)并令其等于零，解方程組既得X1=0，X2=-0.164 1，X3=0.078 5，X4=-0.030 23.即提取裂褶菌多糖的最佳工藝條件是：提取時(shí)間為20 min，料液比為1∶28.5 g·mL-1，提取溫度為51 ℃，微波強(qiáng)度為548 W.

通過軟件分析，當(dāng)裂褶菌多糖產(chǎn)量最高組合為：X1=20 min；X2=1∶28.5 g·mL-1；X3=51 ℃；X4=548 W，即最佳提取工藝為：提取時(shí)間為20 min，料液比為1∶28.5 g·mL-1，提取溫度為51 ℃，微波強(qiáng)度為548 W.此條件下，多糖理論提取量為1.78%.為了檢驗(yàn)所得結(jié)果的可靠性，采用優(yōu)化條件進(jìn)行提取試驗(yàn)，實(shí)際測得值為1.76%，與理論值相比，0．1%以內(nèi)的相對誤差，因此，響應(yīng)曲面法所得的優(yōu)化條件，裂褶菌多糖提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值.

圖5 料液比與提取時(shí)間對裂褶菌多糖提取率的影響

圖6 微波強(qiáng)度與提取時(shí)間對裂褶菌多糖提取率的影響

圖7 提取溫度與提取時(shí)間對裂褶菌多糖提取率的影響

圖8 提取溫度與料液比對裂褶菌多糖提取率的影響

圖9 微波強(qiáng)度與料液比對裂褶菌多糖提取率的影響

圖10 微波強(qiáng)度與提取溫度對裂褶菌多糖提取率的影響

3 結(jié)論

1)通過單因素試驗(yàn)，確定了裂褶菌多糖提取的最經(jīng)濟(jì)、最適用的范圍，提取時(shí)間20 min，料液比為1∶30 g·mL-1，提取溫度50 ℃，微波強(qiáng)度550 W.

2)利用Design-Expert 7.0軟件響應(yīng)面法，建立二次回歸模型方程：Y=1.89+0.033 1X1+0.013 8X2+0.010 1X3+0.036 5X4-0.074 2X12-0.029 2X22-0.079 6X32-0.055 3X42-0.047 2X1X2+0.005 4X1X3-0.049 7X1X4-0.016 4X2X3-0.018 2X2X4-0.001 0X3X4.回歸方程擬合的較好，可以用方程預(yù)測裂褶菌多糖的提取工藝參數(shù).

3)通過計(jì)算與驗(yàn)證得到裂褶菌多糖的最優(yōu)提取工藝條件為：提取時(shí)間為20 min，料液比為1∶28.5 g·mL-1，提取溫度為51 ℃，微波強(qiáng)度為548 W.此條件下，多糖理論提取率為1.78%，實(shí)際提取率為1.765%，相對誤差為0.1%，預(yù)測值與實(shí)際值之間擬合性好.

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