李雨春，王善青，胡錫敏，王光澤，蒙 鋒，曾 文，陳春香，童重錦

間日瘧原蟲裂殖子表面蛋白1(PvMSP-1)是廣泛表達于間日瘧瘧原蟲裂殖子表面并參與免疫反應(yīng)的優(yōu)勢抗原，也是檢測瘧原蟲較為有價值的多態(tài)性標記物之一[1]。該基因由10個保守區(qū)和可變區(qū)組成的，其中由兩側(cè)保守區(qū)域5(ICB-5)和6(ICB-6)組成第5區(qū)域(Block5)的顯示多態(tài)性特點，依據(jù)該區(qū)域的氨基酸組成類型分為Belem 類型(Ploy-Q)、Salvador-1型以及二者重組性[2]。這些基因類型對間日瘧進行有效的分子流行病學(xué)監(jiān)測和分子生物學(xué)研究[3]。海南省曾是我國瘧疾高發(fā)區(qū)域，主要以惡性瘧和間日瘧為主，近年來海南瘧疾疫情大幅下降，本地瘧疾發(fā)病率逐年降低，但間日瘧發(fā)病數(shù)占報告病例比例呈現(xiàn)逐年上升趨勢。海南于2010年7月正式開展消除瘧疾工作，在海南省消除瘧疾前期，我們自2009年收集了對海南本地流行的間日瘧原蟲株，并對這些蟲株的MSP-1基因進行序列分析，以便對消除瘧疾后期有效對輸入性瘧疾和本地瘧疾進行更好的分子水平的監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1調(diào)查區(qū)概況和樣本采集 收集全省2009-2012年網(wǎng)報間日瘧病例共36份，有效擴增并完成測序共30份，其中本地病例27份，輸入性病例3份，分布于海南省瘧疾流行6個市縣。

1.2DNA 提取及MSP-1PCR擴增 采用Qiagen Mini Blood DNA 提取試劑盒對血樣進行DNA提取，80 μL全血，180 μL ATL緩沖液，20 μL蛋白酶K，56 ℃孵育1 h, 隨后按照試劑盒說明進行DNA提取，最后加入80 μL TE緩沖液-20 ℃保存。采用特異性引物MSP-1A(5′-GAGCCCTACTACTTGATGGTCC-3′) 和 MSP-1B (5′-CCTTCTGGTACAGCTCAATG-3′)對間日瘧MSP1基因進行擴增[4]，20 μL擴增體系如下：DNA模板5 μL，1× reaction buffer，2.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L of each dNTP, 10 pmol引物和1 UpfuDNA polymerase(Tiangen, Beijing). 反應(yīng)條件：95 ℃變性5 min, 35 個循環(huán)95 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 90 s; 72 ℃延伸5 min, PCR 反應(yīng)產(chǎn)物1.5%瓊脂糖電泳檢測。

1.3序列分析及進化樹構(gòu)建 ExPASy Molecular Biology (http://us.expasy.org/) 用來將核酸序列翻譯成蛋白序列， WBioEdit version 7.0軟件(www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/BioEdit.html), CLUSTAL X and EditSeq 3.88(DNASTAR, Madison,WI)用來序列比對和分析. MEGA 3.1 用來進行遺傳進化樹構(gòu)建和遺傳進化分析。

2 結(jié)果

2.1樣本分布情況 從全省網(wǎng)報瘧疾樣本分布情況來看，網(wǎng)報間日瘧病例主要集中在海南中南部地區(qū)，東部北部地區(qū)相對較少，見表1。

2.2PvMSP-1 基因分析 從27個間日瘧樣本分析來看，Sal-1型有24個，占全部樣本數(shù)的88.8%，9個Sal-1亞型，屬于優(yōu)勢型。Belem 型有2個，同屬于1個Belem型，占樣本數(shù)的7.4%，重組型的有1個，占全部樣本數(shù)的3.7%,表2。

表1 2009-2012年收集間日瘧病例分布情況

表2不同亞型的間日瘧裂殖子表面蛋白(MSP-1)數(shù)量及氨基酸替換序列

Tab.2Numbersofdifferentsubtypesofmerozoitesurfaceprotein-1ofPlasmodiumvivaxandsequencingofaminoacidwithsubstitutes

TypeNosCharacteristic sequencing of amino acidSal typeVIAAENTNSal-a7QATAAEDKKEYEKTNQNMYNSal-b1QATAAEDKKEYEKTNQNIDNSal-c3HVTAVQKNNSal-d1ATAVQKNSSal-f2PVTAVQNTNSal-g3VTAVQKNSSal-h1HVTAVQKNNSal-i5ATAVQKNSSal-j1QVTTVQKNSBelem typeBelem-12KKELLDQYKLNADEQNKINET(20 Ploy Q)Recombinant typeRecombinant type-11NTVADIAKSATGTGNVQAVTKEDQKQNKEN (19 PloyQ)

以Sal-1標準株(AAN86207)為參考序列，我們發(fā)現(xiàn)在不同亞型間主要發(fā)生8處氨基酸序列的替換，(V/A, I/T, A/T, A/V,E/Q,N/K,T/N,N/S)和1處由組氨酸或脯氨酸或谷氨酰胺氨基酸的插入。在a亞型和b亞型種還發(fā)現(xiàn)有DKKLLKEYELNADEKTKINQN連續(xù)的氨基酸替換，其中b亞型在連續(xù)替換的基礎(chǔ)上還有M/I, Y/D的2次連續(xù)替換。Belem型只有1個亞型，與參考序列相比(AAN86208)該亞型有一個連續(xù)氨基酸替換序列KKELLDQYKLNADEQNKINET，并含有20個多聚谷氨酰胺序列。重組型的各含有Sal型和Belem型的部分序列，有19個多聚谷氨酰胺序列,圖1。

圖1 不同亞型間日瘧裂殖子表面蛋白氨基酸序列比對結(jié)果

2.3PvMSP-1 進化樹分析 通過進化樹分析可以看出，間日瘧Sal-1型與Belem型及重組型可以較好的區(qū)分開，屬于不同進化簇。經(jīng)進一步比較發(fā)現(xiàn)，Belem亞型(Hainan B-1)的蟲株與Belem 參考序列(AAN86208)和土耳其蟲株(CAD38667)的同源相似性均為94%，且與土耳其蟲株同源相似性高；在Sal株系中，Hainan a亞型和b亞型與參考序列(AAN86207)的同源相似性分別達到95%和94%，而Hainan c-i亞型與參考序列的同源相似性均為97%。另外，還發(fā)現(xiàn)Hainan a亞型和b亞型獨立成一簇，而其他Sal亞型與其他國家的株系親緣關(guān)系較近，同屬一個大簇，如Hainan S-c，Hainan S-e，Hainan S-f，Hainan S-g，Hainan S-i與巴西株(AAN86239)相近,同源相似性達到99%，Hainan S-d，Hainan S-h與伊朗株(AAM53559)相近，同源相似性達到100%。而重組型的海南株雖屬于同一重組型的大類，但海南株與其他重組株還有較遠的親緣關(guān)系，與福建株(AAS46772)和朝鮮株(AAG53740)相似性分別是98%和90%，見圖2。

3 討 論

海南省位于我國北緯25°以南地區(qū)，是我國高度瘧疾流行區(qū)域，主要流行惡性瘧和間日瘧。近年來，在我國政府和全球基金的支持下，我省瘧疾疫情得到有效遏制，流行程度大幅減低，流行范圍明顯縮小，2010年正式實施消除瘧疾策略。自2010年后，未有本地感染的惡性瘧報告病例，以間日瘧流行為主[5]。

間日瘧在海南省均有分布，但近年來隨著消除瘧疾工作推進，我省間日瘧主要分布在海南南部地區(qū)，中北部地區(qū)病例較少。從表1中樣本分布可以看出，南部地區(qū)如保亭三亞報告病例占所有病例的50%以上。海南省間日瘧的消除過程可能是從北部地區(qū)開始，到中部，最后是集中南部區(qū)域。對這些間日瘧本地病例間日瘧裂殖子蛋白1基因分析得知，裂殖子表面蛋白1基因(MSP-1)具有較強的多態(tài)性，27份樣本中竟然有11個不同亞型的蟲株，并且形成Salvador-1型仍是優(yōu)勢基因型，其次Belem 類型(Ploy-Q)，而重組性較少，這一結(jié)果與張山鷹[6-8]，江鋼鋒[9]報告一致。說明海南省消除瘧疾階段，間日瘧流行株系的MSP1仍以Salvador-1為主。另外，本次調(diào)查還發(fā)現(xiàn)2種新型基因亞型的蟲株(Sal-a和Sal-b)，該基因型不僅發(fā)生單個氨基酸之間的替換，更重要的該基因型是有連續(xù)的與Belem型相似的氨基酸替換。這一發(fā)現(xiàn)在國內(nèi)尚未見類似的報道，但韓國的Sung-Ung Moon、緬甸曼德勒同樣也發(fā)現(xiàn)類似的氨基酸替換Salvador-1型[10]。Sal-c和Sal-i未發(fā)現(xiàn)連續(xù)的氨基酸替換，僅有個別氨基酸的零星點替換。從構(gòu)建的進化樹結(jié)果也支持上述結(jié)論，本次實驗發(fā)現(xiàn)的Salvador-1型中各亞型主要被劃分為3個大類，其中Sal-a和Sal-b與其他亞型差距較大，獨成一類，而其余亞型相對聚集性一類。Belem型本次調(diào)查中雖有2例但同屬于同一亞型，為常見20個谷氨酰胺的重復(fù)，從進化樹得知，該型與其他亞型同屬于常見Belem型。重組型僅有一個亞型，屬于為II/Q/S型重組型，但該重組型在基因庫中未發(fā)現(xiàn)同源序列，可能屬于新型的重組亞型，有待于進一步研究。本次調(diào)查中，尚未發(fā)現(xiàn)不同等位基因型的混合感染型和朝鮮型的蟲株，可能與瘧疾疫情得到有效控制，傳播減少有關(guān)。

圖2海南不同亞型間日瘧氨基酸序列進化樹

Fig.2PhylogenetictreeconstructedbyaminoacidindifferentsubtypesfromHainanIsland

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