孟德娣，王 林，樓 研，房功思，沈繼龍

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種世界性分布的專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，可感染包括人類在內(nèi)的幾乎所有恒溫動物，引起人獸共患弓形蟲病。人類對弓形蟲普遍易感，據(jù)估計全世界約有1/3的人感染弓形蟲，中國人群弓形蟲血清抗體平均陽性率為7.88%[1]。人類感染弓形蟲主要通過攝入含有包囊的生的或未煮熟的肉類，食入被卵囊污染的食物或飲水，及母嬰垂直傳播[2]。正常人群感染弓形蟲后主要表現(xiàn)為無癥狀的隱性感染，但對免疫功能低下或缺陷者(如惡性腫瘤、器官移植及HIV感染者)，則可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害，甚至導(dǎo)致致死性機會感染。

已知全球弓形蟲基因型主要來源于6個分支進(jìn)化單位，且在不同地域具有不同的優(yōu)勢基因型[3]。在北美、歐洲弓形蟲的基因型主要以無性系原型(archetype)克隆譜系I、II和III型為主[4-5].I型對小鼠的致死劑量為一個速殖子，屬強毒株；II和III型對小鼠的致死劑量超過1000個速殖子，屬弱毒株。最近報告，Type 12為流行北美野生動物中的優(yōu)勢基因型[6]，而在南美地區(qū)，其基因型具有豐富的遺傳多樣性，主要為非典型[7]。在非洲，弓形蟲分離株基因型主要以II型和III型為主； Africa 1型和Africa 3型也是流行于非洲的優(yōu)勢基因型[8]。我們對中國東南、中部和西部地區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中國弓形蟲分離株具有有限的遺傳多態(tài)性，且China 1型為其優(yōu)勢基因型[1,9-11]。西南地區(qū)具有豐富的遺傳多樣性，作為弓形蟲宿主的動物種類較多，但該地區(qū)弓形蟲的遺傳進(jìn)化和毒力未見報道。本文采用PCR-RFLP對中國西南地區(qū)(貴陽)貓源弓形蟲株進(jìn)行基因分型，探討其與中國其他地區(qū)有無遺傳差異，以及分離株對不同品系小鼠的毒力?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物和蟲株 貓購自于貴州貴陽，雌雄各半，所有貓均麻醉處死，取腦組織進(jìn)行弓形蟲蟲株分離。雌性KM，BALB/c，C57BL及ICR小鼠各10只，SPF級， 5～6 w齡，體重20±2 g，購于安徽省實驗動物中心，室溫下自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料、飲水。參考蟲株DNA (GT1(基因I型)，PTG(基因II型)，CTG株(基因III型))由美國田納西大學(xué)蘇春雷教授惠贈。

1.2試劑及主要儀器 DNA純化試劑盒購自德國QIAGEN 公司；PCR預(yù)混液購自美國Promega 公司；瓊脂糖購自美國Invitrogen公司；限制性內(nèi)切酶Sau96Ⅰ，HaeⅡ,Hinf I,TaqI,NciI,BsiE I,MseI,BsmA I,MboII,HpyCH4 Ⅳ,RsaI,HaeIII,NlaIII,AvaI,AflII,DdeI購自美國Ferments公司；PCR純化試劑盒購自杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司；SAG1，SAG2，SAG3，BTUB，GRA6，c22-8，c29-2，L358，PK1，Apico引物由上海生工生物工程有限公司合成；凝膠成像系統(tǒng)為珠海Hema公司產(chǎn)品，ATC 201型 PCR 擴(kuò)增儀為美國 Apollo 公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1貓源弓形蟲的分離 采取與文獻(xiàn)報道[12]相似的方法：取貓腦組織50 g，加入125 mL無菌生理鹽水，制備形成勻漿液，加入 37 ℃預(yù)熱的鹽酸胃蛋白酶消化液，置恒溫?fù)u床中，37 ℃，150 r/min，消化1 h。離心，棄上清液，加入約 20 mL 的 PBS，用1.2%碳酸氫鈉溶液調(diào)pH為中性，離心，滅菌生理鹽水稀釋，(氨芐西林1 000 U,鏈霉素 100 μg/mL)制成混懸液。將上述組織懸液腹腔接種KM小鼠3只，每只小鼠接種 1 mL。每d觀察，如小鼠有豎毛、弓背、厭食等明顯癥狀時，收集腹腔灌洗液涂片，鏡檢。

1.3.2弓形蟲DNA的提取與基因分型 分別取弓形蟲感染小鼠的腹水，PBS洗滌3次，離心收集弓形蟲速殖子后，用QIAamp?DNA Mini kit試劑盒提取基因組DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

使用蘇春雷等發(fā)表的SAG1、SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、c22-8、c29-2、L358、PK1及Apico基因特異性引物[5]，以弓形蟲參考蟲株及本室分離株的基因組DNA為模版，擴(kuò)增上述10個基因片段，反應(yīng)總體積為50 μL，其中PCR master mix 25 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板1.5 μL。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次，最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，每管取5 μL PCR產(chǎn)物在含溴化乙錠(Ethidium Bromide，EB)的1%瓊脂糖凝膠中100 V電泳30 min，并在凝膠成像儀中觀察結(jié)果。然后各管余下PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后用DNA膠回收試劑盒切膠回收，純化的PCR產(chǎn)物用相應(yīng)的內(nèi)切酶酶切。酶切后產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳，0.5 μg/mL溴化乙錠染色后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并記錄結(jié)果。

1.3.3弓形蟲的毒力 弓形蟲CT-1株感染KM小鼠，待出現(xiàn)明顯癥狀后收集腹水，PBS洗滌3次后經(jīng)梯度離心法純化速殖子[1]，純化后速殖子經(jīng)PBS稀釋至2 mL置顯微鏡下計數(shù)，按1×103個/只腹腔感染SPF級KM，BALb/c，C57BL，ICR小鼠，每組10只。逐日觀察小鼠狀態(tài)并計算死亡率和存活時間，至感染后45 d頸椎脫臼處死各組存活小鼠，腦組織壓片觀察包囊是否形成。累積死亡率=死亡小鼠個數(shù)/感染小鼠個數(shù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。根據(jù)不同品系的小鼠的存活時間、死亡率，采用χ2檢驗對CT-1蟲株感染4種品系小鼠反應(yīng)有無差異，χ2分割法對不同品系小鼠的兩兩檢驗。

2 結(jié) 果

2.1弓形蟲基因分型 采用10個遺傳位點，對本室分離的2株貓源弓形蟲株進(jìn)行基因分型，共揭示了1個基因型(ToxoDB#9, China 1)(表1)。基因型China 1型在SAG2、GRA6、L358、PKl、c22-8位點為基因II型；在SAG3、BTUB、c29-2位點為基因III型；在Apico位點為基因I型，圖1。

2.2小鼠毒力 BALB/c、C57BL、KM 、ICR四個品系雌鼠各10只，經(jīng)腹腔接種1×103個CT-1蟲株速殖子。小鼠的生存時間和死亡率觀察結(jié)果見圖2。C57BL小鼠感染后第5天開始出現(xiàn)豎毛、腹水、抽搐等明顯癥狀甚至死亡，第6 d完全死亡。BALB/c小鼠在第5、6、7這3 d之內(nèi)全部死亡。KM 小鼠感染后6-7 d，活動減少，出現(xiàn)弓背、豎毛等癥狀，第10 d死亡2只小鼠，感染后第15 d至觀察45 d結(jié)束，小鼠恢復(fù)正?；顒樱恢贝婊?。ICR小鼠相對于BALB/c、C57BL小鼠癥狀輕微，在第10、14 d分別死亡了2只和1只小鼠，其余的在45 d內(nèi)存活。存活的感染小鼠45 d后頸椎脫臼處死，腦組織壓片發(fā)現(xiàn)有大量包囊形成。通過進(jìn)行不同品系小鼠毒力對比，顯示CT-1蟲株感染C57BL、BALB/c、KM、ICR小鼠死亡率有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，C57BL、BALB/c小鼠兩者之間及KM、ICR小鼠兩者之間對蟲株無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)。

表1 中國貴陽2株貓源性弓形蟲蟲株基因分型

Note:*unique RFLP genotypes

圖1酶切電泳圖

A：SAG2位點 B：SAG3位點 C：L358位點

Fig.1RestricteddigestionofPCRproductbyagarosegelelectrophoresis

A: SAG2; B: SAG3; C: L358; M: 700 bp marker;

I, II and III: GT1, PTG, and CTG; 1 and 2: CT-1 and CT-2.

圖2 弓形蟲CT-1蟲株感染不同品系小鼠的毒力

3 討 論

最近的研究顯示，流行中國的動物源性弓形蟲分離株具有有限的遺傳多樣性，且China 1型(ToxoDB#9)為其優(yōu)勢基因型[1,9-11]。China 1基因型在SAG2、GRA6、L358、PK1、c22-8位點為基因II型，在c29-2、SAG3及BTUB位點為基因III型，在Apico位點為基因I型。Dubey等[13]首先采用PCR-RFLP技術(shù)對分離自中國廣東貓源弓形蟲株進(jìn)行基因分型研究，通過擴(kuò)增10個遺傳標(biāo)記，將15個弓形蟲株分為基因ToxoDB#9型。隨后，又有很多應(yīng)用PCR-RFLP方法對中國不同地域貓源性弓形蟲株進(jìn)行遺傳特性研究。本實驗室和其他學(xué)者[1,9,14]對從中國華東(山東，江蘇，安徽)、華南(廣東)、華中(湖北)和華北(北京、山西)地區(qū)分離的54株貓源性弓形蟲株，在SAG1、SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、c22-8、c29-2、L358、PK1和Apico等10個位點進(jìn)行PCR-RFLP分析(見表2)，并結(jié)合動物實驗進(jìn)行毒力鑒定，結(jié)果顯示所有的分離株共包含4個基因型，分別為ToxoDB#9(China 1)型(41/54)、ToxoDB#10 (Type I)型(1/54)，ToxoDB#3型(8/54)， ToxoDB#205型(4/54)。因此，China 1基因型為中國貓源性弓形蟲株優(yōu)勢基因型。基因型China 1亦在分離自中國不同地域的豬源及人源性弓形蟲中亦有過報道[9-11]。 同時，China 1基因型在亞洲的越南、斯里蘭卡，南美的巴西、哥倫比亞及北美的雞源，貓源和狗源弓形蟲分離株中均有過報道，表明China 1基因型為中國優(yōu)勢基因型并在全球廣泛分布[2]。本研究對貴州貓源性弓形蟲株進(jìn)行生物與遺傳特性研究，運用PCR-RFLP技術(shù)對10個遺傳位點進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均為China 1型，進(jìn)一步驗證了我國弓形蟲株具有有限的遺傳多態(tài)性。

表2 中國各地區(qū)報道的貓源性弓形蟲基因型

貓科動物是弓形蟲生活史中唯一的終宿主，可分泌對環(huán)境有抵抗力的卵囊，污染食物，飲水和土壤，增加包括人在內(nèi)的絕大多數(shù)哺乳動物、家畜和家禽的感染，全國各地調(diào)查貓弓形蟲感染率隨著地域差異有所變化，中國蘭州陽性率21.3%，廣東為25.2%～79.4%，北京為14.1%～57.8%[15-16]。孕婦感染弓形蟲可通過胎盤傳播導(dǎo)致胎兒出現(xiàn)嚴(yán)重的感染甚至死亡，正常人感染弓形蟲后通常形成無癥狀的隱性感染狀態(tài)，當(dāng)人免疫力降低時(如腫瘤患者、艾滋病及器官移植者)可引起嚴(yán)重的疾病甚至死亡。

弓形蟲屬僅有剛地弓形蟲一種，但來自全球各地的分離株卻具有豐富的遺傳多樣性，不同蟲株基因有微小差異，對小鼠毒力卻存在很大差異。不同基因型的弓形蟲感染不同活化的巨噬細(xì)胞亞群，調(diào)節(jié)不同的信號通路。已經(jīng)明確棒狀體蛋白激酶ROP16和致密顆粒蛋白GRA15都是毒力決定因子。Ⅰ型和Ⅲ型弓形蟲的ROP16能夠組成性地磷酸化STAT6，使巨噬細(xì)胞極化為M2；而Ⅱ型弓形蟲GRA15則活化NF-κb，誘導(dǎo)促炎癥性的M1基因表達(dá)[20]。中國優(yōu)勢基因型(China 1型)弓形蟲株不同蟲株對小鼠的毒力不同。王林等用China 1 型弓形蟲株腹腔感染SW小鼠，發(fā)現(xiàn)大部分蟲株在1周內(nèi)致死所有小鼠；但是TgCtwh6(China 1型)蟲株感染小鼠只出現(xiàn)一過性的炎癥反應(yīng)，且感染3周后在存活小鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量的包囊[9]。陳兆武等用14株蟲株感染KM小鼠，提示為China 1型弓形蟲株強度株，有趣的是已經(jīng)證實為強毒株的TgCtys1, TgCtwh1 和 TgCtwh4感染小鼠可存活至45 d，同時腦組織中含有大量包囊[1]。錢偉鋒等用同一基因型弓形蟲株TgCatBj2不同劑量腹腔感染BALB/c小鼠，發(fā)現(xiàn)China 1型弓形蟲株為中等毒力株[19]。據(jù)此推測，流行我國的優(yōu)勢基因型China 1型弓形蟲株存在不同毒力株。目前為止，優(yōu)勢基因型China 1型弓形蟲株感染不同品系小鼠的生存時間和死亡率鮮見報道，本文用CT-1蟲株1 000個速殖子腹腔感染近交系小鼠(C57BL、BALB/c)和遠(yuǎn)交系小鼠(ICR、KM)，觀察感染小鼠的存活時間和死亡率。顯示同一蟲株的毒力隨不同品系小鼠反應(yīng)不同，死亡率差異明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。近交系小鼠中C57BL、BALB/c小鼠分別在6、7 d內(nèi)全部死亡，兩者之間對蟲株的反應(yīng)無明顯差異(P>0.01)，與李亞飛等[20]的報道相似，說明近交系小鼠無胸腺，細(xì)胞免疫缺陷，對China 1型抵抗力低，是研究弓形蟲急性感染的理想模型。遠(yuǎn)交系KM、ICR小鼠對CT-1蟲株有更強的耐受性，存活率高，兩者之間無明顯差異，而且在腦組織中發(fā)現(xiàn)大量包囊，因此為研究弓形蟲慢性感染的發(fā)病機制、生物學(xué)特征等相關(guān)研究提供了良好的感染動物模型。因此，用China 1基因型對不同品系小鼠的探求為后續(xù)研究提供了一個科學(xué)、適宜的小鼠感染模型。

總之，在中國西南地區(qū)弓形蟲的基因分型及毒力研究豐富了我國弓形蟲種群遺傳學(xué)、流行病學(xué)研究的資料，為更好地理解弓形蟲基因型相關(guān)的致病機制具有重要意義。

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