高 俊，呂 龍，陳 功

表皮生長因子受體3(Her3)基因編碼的表皮生長因子受體(EGFR)受體酪氨酸激酶3，由于其沒有胞內(nèi)信號傳遞域，常與其他表皮生長因子受體形成異二聚體轉(zhuǎn)導(dǎo)生長信號。已有的報道表明，Her3在包括乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌及膀胱癌的眾多腫瘤中高表達(dá)[1-3]。本研究利用siRNA技術(shù)研究，下調(diào)Her3在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)，研究Her3對于結(jié)腸癌細(xì)胞增殖凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2007年1月至2011年12月我院行結(jié)腸癌切除術(shù)男性患者60例，平均年齡47.8歲；女性患者30例，平均年齡42.9歲。每例均在無菌條件下同時取癌組織及手術(shù)切緣處(距腫瘤5 cm以上)正常結(jié)腸黏膜組織各一塊。非典型增生的標(biāo)本90例，來源于腸鏡檢查摘除，并經(jīng)由病理科確診。

1.2 方法

1.2.1 熒光實(shí)時定量RT-PCR 提取采集研究對象的組織，采用Trizol抽提法提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA公司)說明書合成cDNA，反應(yīng)體系為20 μl。5×PCR緩沖液4 μl，OligodT以及隨機(jī)六聚體引物各1 μl，總RNA為2 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶混合物1 μl，加雙蒸水至20 μl。引物的設(shè)計(jì)與合成利用生物信息學(xué)知識及RT-PCR對引物的要求，使用Oligo6.0設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，由上海生物工程有限公司合成，引物序列及擴(kuò)增長度詳見表1。RT-PCR使用TAKARA公司的sybergreenI mix試劑盒，反應(yīng)體系為20 μl，其中2×賽柏格林(Sybergreen)預(yù)混液 10 μl，校正染料0.3 μl，互補(bǔ)鏈脫氧核糖核酸(cDNA) 1.5 μl，上下游引物各0.5 μl，加雙蒸水至20 μl。使用ABI公司7300型real-time PCR儀，反應(yīng)條件為：94℃ 5 min，94 ℃15 s，58 ℃15 s，72 ℃15 s，共35個循環(huán)，擴(kuò)增反應(yīng)完成后又進(jìn)行了溶解曲線的制作，確保擴(kuò)增的特異性。

1.2.2 免疫組織化學(xué) 60例結(jié)腸癌標(biāo)本4%的中性甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋的腫瘤組織切至4 μm厚切片，經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水，室溫中30 ml/L過氧化氫甲醇溶液中浸泡30 min，以抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。切片在EDTA(0.01 mol/L，pH 8.0)中煮20 min以修復(fù)抗原。PBS漂洗3次后，切片用正常山羊血清孵育10 min以阻斷非特異性反應(yīng)。一抗相應(yīng)抗原單克隆抗體(1∶500)在濕盒中4 ℃過夜，PBS漂洗3次，滴加二抗試劑，室溫下孵育10 min后PBS漂洗3次，滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫下孵育10 min后再用PBS漂洗3次，最后二甲胺二氮苯(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染、透明、脫水、封片。以PBS替代一抗行陰性對照。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定 使用專業(yè)圖像分析軟件Image-Pro Plus(版本號5.0)分析圖片，每張切片選取5個視野(×200)，經(jīng)軟件分析求得平均光密度值(integrated optical density, IOD)，用此種方法對每張切片中Her3的表達(dá)做出量化的評價。

1.2.4 轉(zhuǎn)染 使用Invitrogen公司的Lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體如下：轉(zhuǎn)染前1天按5×104/孔的密度接種于24孔板，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將0.8 μg psilencer 2.1-u6-Her3及其對應(yīng)空質(zhì)粒對照按照說明書方法轉(zhuǎn)染SW480及Lovo細(xì)胞，Western-blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 AnnexinV-PI共染檢測細(xì)胞凋亡 利用2%過氧化氫刺激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞包括：Her3表達(dá)沉默及對應(yīng)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對照細(xì)胞；2%過氧化氫刺激12 h后收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次；按照試劑盒說明書(美國invitrogen公司，貨號V13241)加入500 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞；并加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻，室溫、避光、反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀測定。

1.2.6 MTS摻入法檢測細(xì)胞增殖 將SW480，Lovo以及siRNA處理細(xì)胞以每孔5×103個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μl。在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。分別在種入細(xì)胞的6，12，24及72 h進(jìn)行MTS摻入及比色，每組細(xì)胞每個時間點(diǎn)設(shè)3個復(fù)孔，選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果。以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.7 Western-blot 將SW480，Lovo以及siRNA處理細(xì)胞以每孔5×105個細(xì)胞，按細(xì)胞數(shù)量加入裂解液，冰浴后，離心取上清，加入上樣緩沖液，95 ℃煮5 min；按每個樣品30 μg上樣，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)膜，利用相應(yīng)抗體和兔二抗孵育后，利用ECL曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)腸癌及正常組織中Her3的表達(dá)比較應(yīng)用單因素方差分析(SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件)，以P<0.05為有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Her3在人結(jié)腸癌組織中的表達(dá)

利用real-time PCR及免疫組織化學(xué)染色分析Her3在人結(jié)腸癌中的表達(dá)，結(jié)果表明，Her3在人結(jié)腸癌組織中轉(zhuǎn)錄水平較正常組織顯著增高(圖1)，P<0.01。免疫組織化學(xué)結(jié)果表明，Her3在結(jié)腸癌組織中普遍呈陽性(79/90，87.8%陽性率)， 顯著高于非典型增生組織(27/90, 30%)及正常結(jié)腸黏膜組織(15/90, 16.7%)，利用圖像分析軟件，量化免疫組化染色，結(jié)果與陽性率比較一致，即結(jié)腸癌中Her3蛋白的表達(dá)顯著高于非典型增生組織及正常黏膜組織(見圖2、3)。

圖1 real-time PCR檢測人結(jié)腸癌組織中Her3基因的表達(dá)

圖2 軟件統(tǒng)計(jì)免疫組織化學(xué)染色Her3在人結(jié)腸癌(CC)，非典型增生(GD)及正常結(jié)腸組織(Normal)中的表達(dá)

圖3 免疫組織化學(xué)染色Her3在人結(jié)腸癌(A 陽性，B陰性)，非典型增生(×100)及正常結(jié)腸組織中的表達(dá)(×100)

2.2 結(jié)腸癌及癌旁組織中Her3的表達(dá)與AKT信號通路激活的相關(guān)性

利用Western-blot檢測結(jié)腸癌及癌旁組織中Her3的表達(dá)及磷酸化AKT(Ser473)的表達(dá)，結(jié)果表明Her3在結(jié)腸癌組織中高于配對的癌旁組織(圖4)。通過圖像軟件量化條帶灰度值，根據(jù)Her3和p-AKT的灰度值進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明Her3的表達(dá)與AKT信號的激活呈正相關(guān)(r2=0.21,P=0.012)，見圖5。

圖4 Western-blot檢測人結(jié)腸癌中AKT通路與Her3的表達(dá)

圖5 Her3表達(dá)與AKT通路激活的相關(guān)性分析檢驗(yàn)

2.3 Her3對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響

利用siRNA技術(shù)干擾結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480及Lovo中Her3的表達(dá)，通過Western-blot技術(shù)檢測Her3表達(dá)，與轉(zhuǎn)染對照序列的細(xì)胞相比較，兩種干擾片段s1及s2能夠顯著下調(diào)Her3在兩種結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)，干擾效果尤以s2為佳。因此，我們選用s2干擾序列下調(diào)兩種結(jié)腸癌細(xì)胞中Her3的表達(dá)，建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，SW480-Her3-siRNA和Lovo-Her3-siRNA(圖6)。利用MTS摻入實(shí)驗(yàn)分析Her3對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響，分別選擇48 h、72 h及96 h分析細(xì)胞的增殖情況，與對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞株相比，在72 h和96 h，Her3表達(dá)下調(diào)后，細(xì)胞的增殖水平顯著下降(SW480：72 h，P=0.024；96 h，P=0.017。Lovo：72 h，P=0.021；96 h，P=0.013)，見圖7。利用順鉑(1 μg/ml)體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，作用24 h后，利用AnnexinV-PI檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果表明Her3下調(diào)能夠顯著促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480及Lovo的凋亡(SW480，P=0.004；Lovo：P=0.007)，見圖8。

圖6 Western-blot檢測Her3蛋白的表達(dá)

圖7 MTS試驗(yàn)研究Her3對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

圖8 AnnexinV-PI摻入試驗(yàn)研究Her3對結(jié)腸癌細(xì)胞株凋亡的影響

2.4 AKT及MAPK通路與Her3表達(dá)下調(diào)的相關(guān)性 利用Western-blot檢測細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)，分別檢測AKT和MAPK兩條通路的激活情況。加入Her3配體EGF，處理6 h，Her3表達(dá)下調(diào)后，與轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的細(xì)胞相比，SW480-Her3-siRNA及Lovo-Her3-siRNA 中AKT及MAPK的激活顯著下降，見圖9。

3 討論

關(guān)于腫瘤細(xì)胞表皮生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑，腫瘤學(xué)術(shù)界的研究已十分透徹，表皮生長因子可通過其受體——生長因子受體家族向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過PI3K-AKT及MAPK-ERK等信號通路引發(fā)系列生物學(xué)效應(yīng)：包括增殖，生存力，細(xì)胞遷移等。該家族包括HER1(erbB1, EGFR)、HER2(erbB2, NEU)、HER3(erbB3)及HER4(erbB4)[4-5]。HER家族在細(xì)胞生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。由于Her3本身沒有胞內(nèi)信號傳遞域，所以Her3必須與其他受體形成異二聚體發(fā)揮轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的作用，以往以及本研究都表明Her3在結(jié)腸癌中顯著高表達(dá)，而且我們的而研究表明Her3的表達(dá)與AKT的激活呈正比，說明Her3可結(jié)合表皮生長因子通過AKT通路促進(jìn)腫瘤的各種生物學(xué)行為[6-7]。

圖9 Western-blot 檢測Her3表達(dá)下調(diào)后AKT及MAPK通路的激活情況

Her3與其他表皮生長因子受體形成異二聚體對于細(xì)胞分裂十分重要，一旦這種二聚體的功能發(fā)生障礙，細(xì)胞的增殖水平就會受到很大的影響，我們的結(jié)果提示即便細(xì)胞受到表皮生長因子的刺激，Her3的缺失仍然降低了其信號在細(xì)胞內(nèi)的傳遞，從生物學(xué)上表現(xiàn)為增殖水平的下降和腫瘤藥物敏感性的提高，而這些都可能是基于PI3K-AKT和MAPK信號通路。本結(jié)果充分的說明雖然Her3缺乏胞內(nèi)信號傳遞域，但Her3的存在能夠增加表皮生長因子信號的傳遞的效率。

因此，我們覺得Her3是一種有效的治療結(jié)腸癌的靶點(diǎn)，其可能的機(jī)制是影響表皮生長因子及其下游增殖及生存相關(guān)通路。

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