貢 震，蘇亦平，徐寒子，孫志華，吳 強

二維細胞培養(yǎng)(two dimensional cell culture, 2DCC)系統(tǒng)目前仍是惡性腫瘤生物學(xué)研究及治療學(xué)評價最常用的體外平臺。然而，由于體內(nèi)生長的實體瘤是一個三維的細胞群，在細胞與細胞、細胞與微環(huán)境之間存在著廣泛的相互作用和相互影響，因而2DCC系統(tǒng)并不能真實模擬腫瘤的實際發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸情況。隨之，三維細胞培養(yǎng)( three dimensional cell culture, 3DCC)應(yīng)運而生[1]。本項研究選擇Matrigel膠作為3DCC的支撐系統(tǒng)，對卵巢癌細胞株SK-OV-3在2DCC和3DCC系統(tǒng)中的生長特性進行了觀察，現(xiàn)報告分析如下。

1 材料與方法

1.1 試劑 胎牛血清購于杭州四季青公司，RPMI1640為美國GIBCO公司產(chǎn)品，Matrigel為美國BD公司產(chǎn)品，CCK-8試劑盒購于日本Dojindo公司，Brdu檢測試劑盒、細胞周期試劑盒購于南京凱基公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 人卵巢癌細胞株SK-OV-3由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院吳步初博士惠贈。2DCC系統(tǒng)下，細胞生長在含10%胎牛血清的RPMI 1640全培養(yǎng)液中，于37 ℃恒溫、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，每2～3天換液/傳代1次。3DCC系統(tǒng)下，先將Matrigel置于4 ℃過夜，后將其與完全培養(yǎng)液以1∶2稀釋后鋪板(120 μl/孔，24孔板)，37℃孵育15～30 min；收集2DCC系統(tǒng)下消化所得SK-OV-3細胞，重懸細胞于全培養(yǎng)液中，并接種至上述預(yù)包被Matrigel的培養(yǎng)板上(3 000細胞+250 μl全培養(yǎng)液/孔)，培養(yǎng)10～30 min，加入含10%Matrigel的預(yù)冷全培養(yǎng)液置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液1次。

1.3 細胞形態(tài)學(xué)觀察 2DCC或3DCC系統(tǒng)下培養(yǎng)的SK-OV-3細胞，在倒置像差顯微鏡下以Nikon相機定期、隨機拍照，觀察細胞形態(tài)學(xué)變化。

1.4 細胞生長檢測 接種細胞2 000、3 000、10 000細胞/孔于96孔培養(yǎng)板，如前述方法培養(yǎng)，每組設(shè)6個平行孔，并設(shè)無細胞對照孔，72 h后每孔加10 μl CCK-8，孵育4 h上酶標儀測450 nm吸光度(A)；繪制工作曲線，參照工作曲線計算相對細胞數(shù)。

1.5 細胞增殖檢測 接種細胞于培養(yǎng)瓶，同前述條件培養(yǎng)，加入Brdu后8～10 h酶解、收集、固定，石蠟包埋，病理科制備石蠟切片，按Brdu免疫組化試劑盒說明書操作，光鏡下觀察。細胞核染為棕色的即為陽性細胞。

1.6 細胞周期檢測 接種細胞于培養(yǎng)瓶，同前述條件培養(yǎng)后酶解、收集細胞，加預(yù)冷的70%乙醇4℃固定過夜，離心棄去固定液，以50 μg/ml的PI染液及RNase 37 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌、重懸，400目的篩網(wǎng)過濾1次，流式細胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 細胞株在不同培養(yǎng)系統(tǒng)中生長形態(tài)的觀察 在2DCC系統(tǒng)中接種SK-OV-3細胞6～8 h后，大部分細胞呈圓形貼壁狀，部分細胞已鋪展；細胞呈單層貼壁生長，培養(yǎng)2～3 d后細胞生長至匯合，可見細胞簇。在3DCC系統(tǒng)中，接種后立即觀察也呈透亮圓形，2～3 d后可觀察到部分細胞出現(xiàn)分裂相，5～7 d后可多細胞球樣體(multi-cellular spheroid, MCS)形成，此后1～2周內(nèi)MCS逐漸增大至一定程度后再無明顯變化。

2.2 細胞株在不同培養(yǎng)系統(tǒng)中的生長情況 SK-OV-3細胞在2DCC和3DCC系統(tǒng)中的生長情況如圖1所示：2 000或3 000細胞/孔：接種于96孔板后培養(yǎng)3 d，在2DCC系統(tǒng)下生長速度均顯著高于3DCC系統(tǒng)；而10 000細胞/孔組在2DCC系統(tǒng)下生長速度則顯著低于3DCC系統(tǒng)。

圖1 SK-OV-3在2DCC和3DCC系統(tǒng)中生長的對比

2.3 細胞株在不同培養(yǎng)系統(tǒng)中的增殖情況 Brdu為5-溴脫氧尿嘧啶核苷，為胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶(T)在細胞增殖的DNA合成期摻入正在復(fù)制的DNA分子；而后利用抗Brdu單克隆抗體，IHC染色，顯示增殖細胞[2]。結(jié)果顯示，在空白對照組(加入Brdu單抗對照抗體)均未見棕黃色的陽性細胞(見圖2A-B)，而2DCC(見圖2C)或3DCC(見圖2D)培養(yǎng)系統(tǒng)實驗組均可見棕黃色的陽性細胞，且2DCC系統(tǒng)明顯高于3DCC系統(tǒng)。

圖2 SK-OV-3在2DCC和3DCC系統(tǒng)中的增殖(×400)(A：2DCC對照組，B：3DCC對照組；C：2DCC實驗組；D：3DCC實驗組)

2.4 細胞株在不同培養(yǎng)系統(tǒng)中周期分布 以PI單染-流式細胞術(shù)檢測SK-OV-3細胞經(jīng)2DCC和3DCC系統(tǒng)培養(yǎng)后細胞周期分布情況，測定結(jié)果如圖4所示：SK-OV-3細胞在2DCC中培養(yǎng)， S/G2-M期細胞比例為(53.7±5.8)%，顯著高于在3D培養(yǎng)系統(tǒng)中S/G2-M期細胞比例[(40.9±2.0)%，P<0.05]，而G0/G1期細胞比例為(43.5±8.1)%，略低于在3D培養(yǎng)系統(tǒng)中G0/G1期細胞比例(46.9±2.3)%，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 SK-OV-3細胞在2DCC和3DCC系統(tǒng)中生長的周期分布

3 討論

卵巢癌是常見婦科惡性腫瘤之一，在女性生殖道腫瘤中占第3位，同時也是婦科腫瘤中致死率最高的腫瘤[3]。限于對卵巢癌的生物學(xué)研究尚不深入；同時新的治療方法雖不斷涌現(xiàn)[4]，但尚缺乏客觀可靠的評價依據(jù)，因此，發(fā)展卵巢癌生物學(xué)研究及治療學(xué)評價的研究平臺即具有現(xiàn)實意義。

目前，對于實體瘤的體外研究，仍然采用以單層細胞培養(yǎng)為主的2DCC系統(tǒng)。然而，活體中幾乎所有實體瘤細胞的生長都基于由胞外基質(zhì)構(gòu)建的3D微環(huán)境。大量的研究表明微環(huán)境對細胞行為及生理機能都有重要影響，生長在2D環(huán)境下的貼壁生長腫瘤細胞，由于缺乏微環(huán)境的支持與影響，必將失去一些原有的特性與能力。

3DCC系統(tǒng)的開發(fā)與成功應(yīng)用，為腫瘤的生物學(xué)研究及治療學(xué)評價提供了新的手段。3DCC系統(tǒng)可概括為在含基質(zhì)蛋白的半固體膠中或人工合成的微孔支架中培養(yǎng)細胞，使細胞能夠在三維空間中增殖，如同體內(nèi)的組織一樣，形成一定的立體結(jié)構(gòu)。與傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)相比，三維培養(yǎng)在研究腫瘤生物學(xué)特性中具有明顯的優(yōu)勢。這是因為較之2DCC，在3DCC系統(tǒng)中能夠?qū)崿F(xiàn)細胞與細胞間以及細胞與基質(zhì)間的相互聯(lián)系，能夠更好的模擬復(fù)雜的體內(nèi)細胞微環(huán)境[5]。

腫瘤多細胞球體MCS培養(yǎng)模型是發(fā)展最早、同時也是最為成熟的3DCC培養(yǎng)模型[6]。腫瘤組織由于腫瘤細胞結(jié)合緊密，支持物質(zhì)難以進入組織內(nèi)部，營養(yǎng)物質(zhì)分配不均，使實體瘤內(nèi)、外細胞的生長存在差異。2DCC培養(yǎng)系統(tǒng)中，腫瘤細胞均勻接受支持物質(zhì)，生長活躍。而MCS是由多個腫瘤細胞組成的球狀聚集體，在MCS系統(tǒng)中，靠近中心的細胞，能夠直接接觸培養(yǎng)基、氧氣，細胞生長活躍；而越靠近周邊的細胞，氧氣、支持物質(zhì)越少，代謝終產(chǎn)物越多，生長越為緩慢。MCS這種異質(zhì)性的細胞結(jié)合以及球樣體建立的物質(zhì)梯度極類似于體內(nèi)實體瘤微環(huán)境。因此，和腫瘤單細胞相比，MCS是研究實體瘤的更好模型。

本研究采用Matrigel為細胞培養(yǎng)支撐體系[7]，觀察了人卵巢癌細胞株SK-OV-3在此系統(tǒng)下的生長情況。結(jié)果顯示SK-OV-3在培養(yǎng)5～7 d后即可見MCS形成，提示3DCC系統(tǒng)成功建立。

我們進一步對比了SK-OV-3細胞在兩系統(tǒng)中的生長速度，發(fā)現(xiàn)低密度接種SK-OV-3細胞于3DCC系統(tǒng)，其生長速度顯著低于在2DCC系統(tǒng)培養(yǎng)中的生長速度，這可能與3DCC生長方式本身相關(guān)，即相互接觸的細胞可能較早即抑制了彼此的生長；營養(yǎng)和代謝物質(zhì)在3DCC培養(yǎng)情況下的梯度變化對生長也有抑制作用。而高密度接種于3DCC系統(tǒng)結(jié)果剛好相反，其生長速度顯著高于2DCC系統(tǒng)，這可能與2DCC系統(tǒng)已達全接觸抑制，而3DCC系統(tǒng)可以提供更多的生長空間，尚未達全接觸抑制；這也與形態(tài)學(xué)中的觀察結(jié)果相符。

在觀察卵巢癌SK-OV-3細胞增殖及周期的研究中，我們同樣將3DCC系統(tǒng)與2DCC系統(tǒng)進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：增殖的SK-OV-3細胞在2DCC系統(tǒng)中明顯增多；S/G2-M期細胞比例顯著高于在3D培養(yǎng)系統(tǒng)中S/G2-M期細胞比例。因此，我們認為SK-OV-3在3DCC系統(tǒng)中生長受限，可能與其在3DCC系統(tǒng)下細胞增殖受抑、周期阻滯有關(guān)。

綜上所述，通過采用Matrigel作為細胞體外培養(yǎng)的支撐體系，我們成功建立了卵巢癌細胞在體外的3DCC系統(tǒng)，從而為卵巢癌的研究提供了新的更好的體外研究平臺。3DCC對卵巢癌細胞的生長具有較大的影響，而這可能與其在3DCC系統(tǒng)下增殖受抑、周期阻滯有關(guān)。

參考文獻：

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