楊旭升　綜述　張　蕾　審校

糖尿病腎病(DN)已經(jīng)成為全球性的健康威脅，也將是我國(guó)慢性腎臟病的首要病因。然而目前缺乏DN診斷、預(yù)測(cè)及治療標(biāo)記物，且治療有效性仍較局限。腎活檢被認(rèn)為是其診斷的金標(biāo)準(zhǔn),但它也具有不同程度的風(fēng)險(xiǎn),包括出血、疼痛甚至死亡[1]。因此，尋找一個(gè)或多個(gè)無(wú)創(chuàng)、靈敏、特異度高的標(biāo)記物就顯得尤為重要。本文將介紹一相對(duì)較新的標(biāo)記物泛素-核糖體融合蛋白52(UbA52)，是糖尿病患者尿液中的特異性蛋白，它不僅可作為新發(fā)糖尿病腎損害的診斷指標(biāo)，并且這種泛素可能參與了DN的發(fā)病機(jī)制。

泛素-核糖體融合蛋白52(UbA52)

UbA52是一種泛素核糖體融合蛋白，該種蛋白是泛素與核糖體蛋白融合而成。泛素是大多數(shù)真核細(xì)胞中的小蛋白，主要功能是標(biāo)記需要分解的蛋白質(zhì)，使其被水解，泛素由四種不同的基因編碼的，包括Uba52、Ubb、Ubc、Uba80[2]。在人類中,UbA80基因和UbA52基因編碼的泛素分別融合到核糖體蛋白S27A和L40上，從而形成泛素核糖體融合蛋白。UbA52是由128個(gè)氨基酸構(gòu)成，包括由52個(gè)氨基酸構(gòu)成的60S核糖體蛋白與由76個(gè)氨基酸構(gòu)成的泛素肽鏈。 目前認(rèn)為泛素核糖體融合蛋白與一些疾病相關(guān)蛋白或基因的增多呈正相關(guān)。

UbA52與DN的關(guān)系

Dihazi等[3]通過(guò)搜集不伴其他疾病的單純2型糖尿病(T2DM)患者、DN 及非糖尿病性蛋白尿患者的尿液進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)比較發(fā)現(xiàn)，質(zhì)荷比(m/z)6188的蛋白質(zhì)在單純T2DM患者尿液中增加,m/z14766 的蛋白質(zhì)在DN患者尿液中增高。經(jīng)鑒定2種蛋白均屬泛素,m/z14766的蛋白質(zhì)經(jīng)確定為UbA52蛋白。Sun等[4]首次克隆出小鼠UbA52基因，并通過(guò)消減雜交方法發(fā)現(xiàn)DN腎組織中UbA52表達(dá)增加，進(jìn)而應(yīng)用原位雜交等技術(shù)證實(shí)UbA52在腎小管中表達(dá)且與DN的進(jìn)展密切相關(guān)。這一系列的研究成為充分認(rèn)識(shí)UbA52和DN的關(guān)系，并將UbA52發(fā)展為DN 早期診斷的生物標(biāo)志物奠定了基礎(chǔ)。

UbA52參與糖尿病的作用途徑糖尿病導(dǎo)致長(zhǎng)期處于高糖狀態(tài)激活體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，使泛素蛋白酶體途徑(UPP)活性增加，使核因子κB(NF-κB)抑制蛋白(IκB)與NF-κB分離并被包含UbA52的系統(tǒng)泛素化降解，從而激活NF-κB引起炎癥因子釋放，導(dǎo)致微小血管病變。

UbA52參與DN的作用途徑糖尿病患者細(xì)胞內(nèi)高糖可導(dǎo)致超氧化合物形成及活性氧(ROS)物質(zhì)生成增加[5]，導(dǎo)致氧化應(yīng)激并在糖尿病并發(fā)癥尤其是大小血管并發(fā)癥的發(fā)展進(jìn)程中起了至關(guān)重要的作用[5-7]。研究表明，采用蛋白酶抑制劑蛋白酶體正調(diào)節(jié)抗氧化系統(tǒng)，可防止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能障礙[8,9]。氧化應(yīng)激會(huì)使UPP中泛素活化酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)活性增加[10]，將NF-κB抑制蛋白(IκB)與NF-κB分離，使IκB被UPP系統(tǒng)泛素化降解，激活NF-κB。NF-κB活化后能調(diào)控一系列基因的表達(dá)，如細(xì)胞間黏附分子1、血管細(xì)胞黏附蛋白、炎性細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素1(IL-1)、IL-6、IL-18]和腫瘤壞死因子等影響腎血管、腎小球?yàn)V過(guò)膜的功能從而參與腎損害過(guò)程[11]。而E1、E2作為泛素的啟動(dòng)酶活性增加可使泛素基因之一的UbA52表達(dá)增加。曾有實(shí)驗(yàn)表明用過(guò)氧化氫刺激細(xì)胞即模仿氧化應(yīng)激狀態(tài)可使UbA52表達(dá)增多[12]。

UbA52作為早期DN的生物標(biāo)志物Dihazi等[3]首次發(fā)現(xiàn)并定義了UbA52，其實(shí)通過(guò)對(duì)DN尿蛋白、DN無(wú)尿蛋白、非DN尿蛋白和正常尿的分離和鑒別發(fā)現(xiàn)了DN的患者會(huì)釋放出大量UbA52而健康對(duì)照組尿液中則沒(méi)有該種蛋白，因此UbA 52 可以作為診斷標(biāo)記。Wada等[13]認(rèn)為一些基因可以在患糖尿病哺乳類動(dòng)物特異性表達(dá)，包括Tim44、 RSOR/MIOX、UbA52等。Sun等[4]認(rèn)為UbA52與DN的發(fā)病機(jī)制有關(guān)系,UbA52的表達(dá)和體內(nèi)血糖水平呈正比并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)在新生糖尿病鼠的腎臟中UbA52的表達(dá)顯著增加，且在腎皮質(zhì)中表達(dá)的最為豐富。上海交通大學(xué)閆焱[12]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，應(yīng)用過(guò)氧化氫刺激造成機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，可引起UbA52和UbB轉(zhuǎn)錄上調(diào)，但UbC無(wú)明顯變化，提示一定程度的氧化應(yīng)激可造成特定的泛素基因激活。這與上述DN發(fā)病機(jī)制中提到的高血糖可引起機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)可激活體內(nèi)的UPP的激活是一致的。即高血糖作為一種刺激使得機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，而該種反應(yīng)可激活UPP使得UbA52等泛素基因表達(dá)增多，降解IκB激活NF-κB導(dǎo)致微血管病變即DN，反映了氧化應(yīng)激、UPP(UbA52在腎臟特異表達(dá))與DN之間的關(guān)系。有文獻(xiàn)提出尿UbA52對(duì)DN診斷的靈敏度大于金標(biāo)準(zhǔn)，因此可作為早期DN的診斷指標(biāo)。UbA52的是公認(rèn)的重要細(xì)胞過(guò)程產(chǎn)物，僅見(jiàn)于糖尿病蛋白尿患者尿液中，建議作為DN的一個(gè)潛在的早期篩查診斷標(biāo)志物[14]。

臨床上缺乏特異的DN早期診斷的臨床指標(biāo)，使用最廣泛的生化預(yù)后指標(biāo)包括，血清肌酐(SCr)、腎小球?yàn)V過(guò)率與白蛋白排泄率、微量白蛋白尿。目前超過(guò)80%的臨床實(shí)驗(yàn)室報(bào)告是通過(guò)SCr測(cè)定來(lái)估計(jì)腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)的，盡管SCr經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化的測(cè)定，但SCr受年齡、性別、飲食等多種因素影響使得其并不能成為GFR評(píng)估的決定性指標(biāo)，導(dǎo)致GFR的估算值不精準(zhǔn)。然而這種不精確估算將導(dǎo)致GFR<60 ml/(min·1.73 m2)的患者被錯(cuò)誤分類及不必要的診斷和治療干預(yù)措施[15]。其次SCr只有當(dāng)腎功能降低到原來(lái)的三分之一時(shí)，才會(huì)出現(xiàn)輕微異常，因此已經(jīng)不能作為評(píng)價(jià)早期腎功能損害的靈敏標(biāo)志物。

對(duì)于白蛋白排泄率而言，一部分患者GFR與白蛋白排泄率變化程度不一致，因此導(dǎo)致對(duì)于患者病變程度判斷不準(zhǔn)確，這將導(dǎo)致新標(biāo)記物的探求，以用于鑒別GFR下降與白蛋白排泄率無(wú)關(guān)聯(lián)性的糖尿病患者?，F(xiàn)在臨床腎臟預(yù)后標(biāo)志物價(jià)值有限,腎活檢仍然是確診的唯一的方法。

UbA52是尿蛋白中可預(yù)測(cè)DN進(jìn)展的理想指標(biāo)，Dihazi等[3]臨床試驗(yàn)證明，健康者對(duì)照組，單純T2DM組、DN組的尿蛋白分別進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，UbA52在DN組患者尿液中明顯增多而其他組別的患者尿液中則未出現(xiàn)。同樣，Otu等[16]對(duì)糖尿病患者進(jìn)行前瞻性隊(duì)列研究，當(dāng)出現(xiàn)DN這一結(jié)果時(shí)，對(duì)試驗(yàn)對(duì)象的尿液進(jìn)行分析后認(rèn)為，DN患者的尿液中存在有12種尿蛋白對(duì)DN的發(fā)生有預(yù)測(cè)作用，UbA52準(zhǔn)確性為89%(敏感度93%，特異度86%)。因此認(rèn)為UbA52可作為DN預(yù)測(cè)和早期診斷的指標(biāo)。

UbA52的檢測(cè)是尿蛋白組學(xué)的一部分，自1996年至2009年7月以來(lái)，在PubMed中發(fā)現(xiàn)使用關(guān)鍵詞“蛋白質(zhì)組學(xué)”或“蛋白質(zhì)組”與“腎”或“尿液”的文章已經(jīng)超過(guò)1 200篇[17]。盡管UbA52是近期研究蛋白組學(xué)在DN的應(yīng)用較好的指標(biāo)，但目前臨床相關(guān)報(bào)道較少，大多數(shù)為研究實(shí)驗(yàn)，此外該項(xiàng)檢測(cè)應(yīng)用于臨床的標(biāo)準(zhǔn)需要大量的樣本，從靈敏度、特異度及影響因素等多方面評(píng)價(jià)。故目前UbA52臨床應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)值范圍尚不明確，是限制其應(yīng)用的主要原因。

尿液是一種易于獲得的生物制劑，其包含的蛋白質(zhì)主要來(lái)自腎臟。隨著尿蛋白組學(xué)的發(fā)展，大樣本的收集，UbA52借助蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于臨床將對(duì)DN做出比傳統(tǒng)指標(biāo)(SCr、GFR與白蛋白排泄率、微量白蛋白尿)更早、更準(zhǔn)確的診斷和預(yù)后評(píng)估。選擇尿液作為生物標(biāo)志物選擇庫(kù)可滿足臨床對(duì)疾病生物標(biāo)志物的需求，目前蛋白組學(xué)應(yīng)用CLINPROT系統(tǒng)可檢測(cè)復(fù)雜體液檢查(如尿液、血液等)，該技術(shù)具有較高的準(zhǔn)確性、靈敏度，重復(fù)性好、檢驗(yàn)費(fèi)用低等特點(diǎn)，適用于臨床檢查。

小結(jié)：全球范圍罹患糖尿病的人數(shù)急劇增加，因此繼發(fā)于糖尿病目標(biāo)靶器官的并發(fā)癥在不久的將來(lái)會(huì)成為最多和最重要的醫(yī)療問(wèn)題，在西方國(guó)家DN已成為導(dǎo)致終末期腎病的主要病因之一[18]，因此對(duì)于一個(gè)與其發(fā)病機(jī)制相關(guān)的指標(biāo)的發(fā)現(xiàn)及檢測(cè)就顯得尤為重要。UbA52的水平與DN患者血糖水平呈正相關(guān)，其具有與DN發(fā)病機(jī)制密切、在腎臟特異表達(dá)且易于獲得等優(yōu)點(diǎn)，相信隨著尿蛋白組學(xué)的發(fā)展、普及，UbA52檢測(cè)對(duì)DN診斷前景光明。

1Ma Y,Yang C,Tao Y,et al.Recent technological developments in proteomics shed new light on translational research on diabeticmicroangiopathy.FEBS J,2013,280(22):5668-5681.

2Lee JH,Lee MJ.Emerging Roles of the Ubiquitin-Proteasome System in the SteroidReceptor Signaling.Arch Pharml Res,2012,35(3):397-407.

3Dihazi H,Müller GA,Lindner S,et al.Characterization of diabeticnephropathy by urinary proteomic analysis:identification of aprocessed ubiquitin form as a differentially excreted protein indiabetic nephropathy patients.Clin Chem,2007,53(9):1636-1645.

4Sun L,Pan X,Wada J,et al.Isolation and functional analysis of mouse uba52 gene and its relevance to diabetic nephropathy.J Biol Chem,2002,277(33),:29953-29962.

5Giacco F,Brownlee M.Oxidative stress and diabetic complications.Circ Res,2010,107(9):1058-1070.

6Ray PD,Huang BW,Tsuji Y.Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling.Cell Signal,2012,24(5):981-990.

7Luo ZF,Qi W,Feng B,et al.Prevention of diabetic nephropathy in rats through enhanced renal antioxidative capacity by inhibition of the proteasome.Life Sci,2011,88( 11-12):512-520.

8Lorenz M,Wilck N,Meiners S,et al.Proteasome inhibition prevents experimentally-induced endothelial dysfunction.Life Sci,2009,84 (25-26):929-934.

9DeRubertis FR,Craven PA,Melhem MF,et al.Attenuation of renal injury in db/db mice overexpressing superoxide dismutase:evidence for reducedsuperoxide-nitric oxide interaction.Diabetes,2004,53(3):762-768.

10 Shang F,Taylor A.Ubiquitin-proteasome pathway and cellular responses to oxidative stress.Free Radic Biol Med,2011,51(1):5-16.

11 Navarro-González JF,Mora-Fernández C,Muros de Fuentes M,et al.Inflammatory molecules and pathways in the athogenesis of diabetic nephropathy.Nat Rev Nephrol,2011,7(6):327-340.

12 閆焱.泛素-蛋白酶體途徑參與人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激過(guò)程的研究，2008，5(1):27-35.

13 Wada J,Sun L,Kanwar YS.Discovery of genes related to diabetic nephropathy in various animal models by current techniques.Contrib Nephrol,2011,169:161-174.

14 Isabel Padr?o A,Ferreira R,Vitorino R, et al.Proteome-base biomarkers in diabetes mellitus:Progress on biofluids' protein profiling using mass spectrometry.Proteomics Clin Appl,2012,6( 9-10):447-466.

15 Inker LA,Schmid CH,Tighiouart H,et al.Estimating glomerular filtration rate from serum creatinine and cystatin C.N Engl J Med,2012,367(1):20-29.

16 Otu HH,Can H,Spentzos D,et al.Prediction of diabetic nephropathy using urine proteomic profiling 10 years prior to development of nephropacthy.Diabetes care,2007,30(3):638-643.

17 Thongboonkerd V.Current status of renal and urinary proteomics:ready for routine clinical application? Nephrol Dial Transplant,2010,25(1):11-16.

18 Luis-Rodríguez D1,Martínez-Castelao A,Górriz JL,et al.Pathophysiological role and therapeutic implications of inflammation in diabetic nephropathy.World J Diabetes,2012,3(1):7-18.