劉玉 趙建民*王雪梅 劉瑞 李強

綜述與講座

細(xì)胞凋亡在激素性股骨頭壞死中的研究進(jìn)展*

劉玉 趙建民*王雪梅 劉瑞 李強

概述

糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的股骨頭壞死（Steroid-induced femoral head necrosis,SIFHN）又稱糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的股骨頭缺血性壞死或股骨頭無菌性壞死，激素導(dǎo)致股骨頭壞死早在20世紀(jì)50年代就已經(jīng)確立。據(jù)推測[1]，目前中國股骨頭壞死患者有500～750萬，每年新增病例約7.5～15萬，激素成為我國股骨頭壞死發(fā)病的首要原因。激素誘導(dǎo)的股骨頭壞死嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和勞動能力，給社會帶來了巨大的負(fù)擔(dān)，大部分患者最終不得不接受人工關(guān)節(jié)置換。如能早期診斷和積極治療后可防止股骨頭塌陷，保護(hù)關(guān)節(jié)功能，控制和延緩病情發(fā)展，可顯著減少致殘率[2,3]。因而激素性股骨頭壞死發(fā)病機制的研究成為近年來國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點，但目前仍沒有完全闡明激素性股骨頭壞死的發(fā)病機制。

過去對糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的股骨頭壞死的發(fā)病機制有多種學(xué)說[4]，主要包括：骨內(nèi)壓增高學(xué)說；骨的灌注下降學(xué)說；脂肪栓塞學(xué)說；高凝狀態(tài)學(xué)說等。近年來越來越多國內(nèi)外研究表明糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)股骨頭壞死與骨細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，Hwang Y等[5]通過激素誘導(dǎo)的兔股骨頭壞死動物模型發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡確實存在于早期激素性股骨頭壞死中，這為治療早期激素性股骨頭壞死尋找新的方法，并為在基因水平上治療股骨頭壞死打下基礎(chǔ)。

細(xì)胞凋亡（Apoptosis）又稱程序性細(xì)胞死亡（Programmed cell death,PCD）是細(xì)胞在一定生理或病理條件下，遵循自身程序結(jié)束生命的過程，最后細(xì)胞脫落、離體或裂解為若干凋亡小體，被其他細(xì)胞吞噬。細(xì)胞凋亡在個體發(fā)育和維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中起著必不可少的作用[6]。細(xì)胞凋亡是多基因嚴(yán)格控制的一個主動過程有復(fù)雜的分子生物學(xué)機制涉及到一系列的基因激活表達(dá)以及調(diào)控等[7]。該過程主要包括以下幾個階段：凋亡的激發(fā)、細(xì)胞內(nèi)凋亡信號傳導(dǎo)及調(diào)控、凋亡效應(yīng)分子激活、蛋白及DNA分子斷裂、細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡包括兩條核心途徑：外源性途徑和內(nèi)源性途徑。

骨細(xì)胞是一種生命周期較長的細(xì)胞。骨細(xì)胞埋藏在骨基質(zhì)的陷窩中，相鄰的骨細(xì)胞彼此聯(lián)系，其特征是胞漿突起通過骨小管伸展到骨基質(zhì)中，并通過臨近骨表面骨細(xì)胞的胞漿突起及骨小管，使骨細(xì)胞與骨表面細(xì)胞相聯(lián)系。因此骨細(xì)胞通過細(xì)胞突起及其間的縫隙連接形成一個廣泛的細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)，通過感應(yīng)骨組織的微小損傷和機械應(yīng)力來完成修復(fù)反應(yīng)，包括代償性的骨增加或減少。另外通過破骨細(xì)胞吸收老化或損傷的細(xì)胞，并為成骨細(xì)胞產(chǎn)生新骨留下一定的空間。正常骨通過以上兩套系統(tǒng)完成其正常的功能，力學(xué)信號的感受、分子信息的傳遞及骨的修復(fù)重建，一般不會看到骨細(xì)胞凋亡。

1 激素導(dǎo)致骨細(xì)胞凋亡

激素可導(dǎo)致股骨頭壞死早已確立，很多學(xué)者對其進(jìn)行了研究，報道常用的激素包括甲潑尼龍琥珀酸鈉（簡稱甲強龍）、醋酸潑尼松龍注射液（簡稱潑尼松）。給藥途徑均為臀肌注射，用量不等，常見用量為20mg/kg或7.5mg/kg，2次/周。骨壞死的后期由于股骨頭血管功能不良從而導(dǎo)致了骨細(xì)胞發(fā)生凋亡。其中Youm Y S等研究發(fā)現(xiàn)[8]使用大劑量糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞凋亡增加，由于凋亡的骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞減少了骨的積累，影響骨的重建和修復(fù)，大量凋亡細(xì)胞的聚集和骨局部不可修復(fù)的缺損將破壞骨細(xì)胞間信息和能量的傳遞網(wǎng)絡(luò)，使骨細(xì)胞的應(yīng)力敏感性下降，導(dǎo)致骨小梁在負(fù)重區(qū)斷裂，最后導(dǎo)致微骨折和股骨頭的塌陷。Kerachian等[9]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡在骨組織累積導(dǎo)致股骨頭發(fā)生壞死、塌陷，隨著骨細(xì)胞凋亡的不斷蓄積，在發(fā)生骨質(zhì)疏松之前就可導(dǎo)致骨壞死的發(fā)生。Weinstein等[10]在激素性股骨頭壞死軟骨下半月征區(qū)域發(fā)現(xiàn)豐富的凋亡骨細(xì)胞，同時還發(fā)現(xiàn)在激素性股骨頭壞死早期，并沒有發(fā)生以壞死為特征的細(xì)胞腫脹及炎性反應(yīng)。細(xì)胞的凋亡可能是骨組織細(xì)胞死亡的機制之一。同樣Eberhardt等[11]指出大劑量激素可引起骨細(xì)胞的活性改變，凋亡是激素性骨壞死的首要變化。當(dāng)骨細(xì)胞凋亡廣泛發(fā)生時，雖然供應(yīng)股骨頭的血管尚無明顯變化，但是骨壞死已經(jīng)發(fā)生。Rojas[12]對患者在器官移植激素治療前后進(jìn)行了骨組織活檢，發(fā)現(xiàn)在使用激素前無成骨細(xì)胞的凋亡，在使用激素后有大量成骨細(xì)胞凋亡。不僅正常成骨細(xì)胞由于使用激素而明顯減少，且未凋亡的骨細(xì)胞大多數(shù)由有活性狀態(tài)轉(zhuǎn)入無活性狀態(tài)，血磷的水平也隨之下降，并隨著激素劑量增加變化更加明顯。

2 骨細(xì)胞凋亡相關(guān)因子及基因

眾多學(xué)者通過激素誘導(dǎo)的股骨頭壞死動物模型，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡確實存在于激素性股骨頭壞死中，這為治療激素性股骨頭壞死尋找新的方法，并為在基因水平上治療股骨頭壞死打下基礎(chǔ)。細(xì)胞凋亡是受基因調(diào)控的精確過程，通過內(nèi)源性和外源性兩條途徑發(fā)揮作用。

2.1 Fas及FasL

Fas及其配體FasL是近年來研究得最為深入的有關(guān)細(xì)胞凋亡的膜表面分子，F(xiàn)as屬于腫瘤壞死因子受體Ⅰ型跨膜蛋白分子，在許多細(xì)胞膜上有表達(dá)。作為細(xì)胞膜表面的受體蛋白，它含有與細(xì)胞凋亡信號傳遞密切相關(guān)的區(qū)域（死亡結(jié)構(gòu)區(qū)域）。Fas配體（FasL）是Ⅱ型膜蛋白，屬腫瘤壞死家族成員，主要在活化T細(xì)胞膜上表達(dá)。Kogianni等[13]研究發(fā)現(xiàn)，激素誘導(dǎo)的骨細(xì)胞凋亡與Fas/FasL凋亡途徑有關(guān)。

2.2 Caspase家族

Caspase全稱為含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，每Caspase都富含半胱氨酸，它們被激活后，能夠在靶蛋白的特異天冬氨酸殘基部位進(jìn)行切割，從而使細(xì)胞不可逆地走向凋亡。Caspase家族是細(xì)胞凋亡的重要執(zhí)行者，Liu等[14]發(fā)現(xiàn)，Caspase-3的活性在細(xì)胞凋亡過程中顯著升高，這說明激素誘導(dǎo)成骨樣細(xì)胞凋亡是依賴Caspase-3的。梁博偉等[15]發(fā)現(xiàn)激素股骨頭壞死模型中骨細(xì)胞膜聯(lián)蛋白A1的表達(dá)下調(diào)，而膜聯(lián)蛋白A1表達(dá)下調(diào)可激活Caspase3進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。

2.3 Bcl-2家族

Bcl-2是細(xì)胞凋亡相關(guān)基因中研究最多的家族，抑制凋亡的基因有Bcl-2、Bcl-XL等，促進(jìn)凋亡的基因有Bax、Bad、Bak等。許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Bcl-2基因與激素有關(guān)，Bcl-2蛋白通過阻斷細(xì)胞凋亡信號傳遞系統(tǒng)的最后共同通道而抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)細(xì)胞成活，成為重要的細(xì)胞生成基因。MoriishiT等[16]在特定的成骨細(xì)胞Bcl-2轉(zhuǎn)基因小鼠研究發(fā)現(xiàn)性類固醇激素缺乏和糖皮質(zhì)激素過多，可以造成骨細(xì)胞凋亡。

2.4 p53基因

P53基因是一種抑癌基因，其生物學(xué)功能是在G1和G2/ M期監(jiān)視DNA的完整性。如有損傷，則抑制細(xì)胞增殖，直至DNA修復(fù)完成，如果DNA不能被修復(fù)，則誘導(dǎo)其凋亡。而且p53基因可通過上調(diào)C-myc、ICE、Fas抗原、bax基因，下調(diào)bcl-2基因，升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。Ookawa等[17]研究發(fā)現(xiàn)p53的表達(dá)可導(dǎo)致大量細(xì)胞停滯在細(xì)胞分化周期的G0、G1和G2階段，由此表明p53基因的表達(dá)可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡。

還有一些其他的相關(guān)基因與因子，例如：O′Brien等[18]在鼠的基因中插入能使激素失活的基因來研究激素對骨細(xì)胞凋亡的潛在作用時發(fā)現(xiàn)，激素能夠直接作用于成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞，并刺激其凋亡，但是破骨細(xì)胞未受影響，從而使骨量減少。此外，Moraes等[19]研究發(fā)現(xiàn)激素能與骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞表面的受體結(jié)合，引起構(gòu)象變化，影響核內(nèi)某些基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。同時其他研究者發(fā)現(xiàn)11-HSD2轉(zhuǎn)基因的小鼠就能有效減少激素引起的骨細(xì)胞凋亡。還有學(xué)者表明，糖皮質(zhì)激素通過激活糖原合酶激酶3（GSK3）誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，而應(yīng)用GSK3抑制劑LiCl后，成骨細(xì)胞凋亡減少[20]。

3 骨細(xì)胞凋亡的實驗室常見檢測方法

骨細(xì)胞凋亡的生理生化過程十分復(fù)雜，細(xì)胞凋亡檢測對于基礎(chǔ)研究和臨床診斷具有重要意義。目前用于體外細(xì)胞凋亡檢測的方法很多，但每種方法都有自身的局限性。骨細(xì)胞不同于軟組織細(xì)胞或者體外培養(yǎng)細(xì)胞，對其的檢測有一定特殊性。例如，流式細(xì)胞術(shù)檢測骨細(xì)胞凋亡較為困難，國內(nèi)尚無用此方法檢測的報道。進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測時，可以選擇合適的方法或多種方法同時進(jìn)行檢測。

3.1 形態(tài)學(xué)觀察

形態(tài)學(xué)觀察是常用的一種通過對樣本進(jìn)行各種染色，應(yīng)用光學(xué)或電子顯微鏡直觀的對凋亡細(xì)胞進(jìn)行觀察。但只能定性，不能定量。

3.1.1 光學(xué)顯微鏡檢測

細(xì)胞涂片或組織切片經(jīng)固定染色后，就可用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。通常用的染色方法有蘇木精-伊紅染色法、甲基綠-派若寧染色法、Giemsa染色法等。蘇木精-伊紅染色后，細(xì)胞質(zhì)呈淡紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核濃縮、染色致密。但需要鑒別的壞死組織呈均質(zhì)紅染，且結(jié)構(gòu)分不清。甲基綠-派若寧染色后，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈綠色，胞質(zhì)呈紅紫色。Giemsa染色后有凋亡小體產(chǎn)生。但由于凋亡細(xì)胞大多發(fā)生超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)改變，而普通光學(xué)顯微鏡只能觀察到胞膜起泡現(xiàn)象和凋亡小體，故利用光鏡常常不令人滿意。

3.1.2 電子顯微鏡檢測

可以觀察到細(xì)胞結(jié)構(gòu)在凋亡不同時期的變化，因此電鏡下觀察凋亡細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變，被認(rèn)為是鑒定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)準(zhǔn)[21]。早期可觀察到細(xì)胞核染色體發(fā)生邊聚，電子密度增強，核形不規(guī)整；胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞體積變小。晚期可看見膜內(nèi)包裹有完整細(xì)胞器和細(xì)胞核碎片的凋亡小體。但電鏡檢測只能定性，不能定量，且對設(shè)備和檢測人員的水平要求較高，費用昂貴樣品制作過程復(fù)雜。

3.2 原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法（TUNEL法）檢測

TUNEL法[22,23]是利用末端轉(zhuǎn)移酶TdT將標(biāo)記的脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移到DNA缺口或3＇羥基末端上，常使用的核苷酸為dUTP，標(biāo)記物為熒光素、地戈辛生物素等。TUNEL法不僅可以對凋亡細(xì)胞進(jìn)行量化，而且可以動態(tài)觀察凋亡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化以及分析細(xì)胞表型。但是它的局限性為只能標(biāo)記中期與晚期的凋亡細(xì)胞，而不能檢測只發(fā)生DNA大片段斷裂的凋亡細(xì)胞。染色體DNA斷裂后會產(chǎn)生大量的黏性3＇-OH末端，生物素標(biāo)記的Dutp、過氧化物酶、堿性磷酸酶形成的衍生物在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶的作用下可與黏性末端結(jié)合，進(jìn)行原位凋亡細(xì)胞的檢測[24-26]。正常細(xì)胞中為完整的雙鏈結(jié)構(gòu)，無黏性末端的形成，故無陽性表現(xiàn)但由于壞死細(xì)胞中斷裂也可產(chǎn)生黏性末端，故可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果，需要結(jié)合其它實驗方法加以排除。

3.3 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）檢測

ELISA法是定量檢測細(xì)胞凋亡的免疫化學(xué)方法。在細(xì)胞凋亡時由于Ca-Mg依賴性核酸內(nèi)切酶進(jìn)入核小體內(nèi)，將雙鏈DNA從各核小體間連接處裂開，形成180～200bp或其整數(shù)倍的寡核苷酸片段。核小體內(nèi)的DNA與組蛋白形成緊密復(fù)合物，不被核酸酶裂解。將核小體上清液加入吸附有組蛋白抗體的微孔板，核小體組蛋白與抗組蛋白抗體結(jié)合。當(dāng)加入過氧化物酶標(biāo)記的DNA抗體后，DNA片段對過氧化物酶底物產(chǎn)生顯色反應(yīng)。ELISA可用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、血清、血漿等的檢測[27]。該方法可檢測早期細(xì)胞凋亡，靈敏度高，適用于多樣本。

3.4 線粒體膜電位的檢測

線粒體在凋亡中起關(guān)鍵作用，是一種電化學(xué)方法。線粒體膜電位是線粒體在尚未發(fā)生明顯的形態(tài)變化時，其膜電位已經(jīng)發(fā)生了變化。線粒體內(nèi)膜兩側(cè)電子分布不對稱導(dǎo)致線粒體膜電位不平衡而形成電化學(xué)梯度，線粒體膜孔道大小的改變會導(dǎo)致線粒體膜電位的改變，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。線粒體膜電位在細(xì)胞凋亡早期已經(jīng)發(fā)生改變，而此時線粒體形態(tài)尚未出現(xiàn)明顯變化，所以線粒體膜電位的下降被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件[28]。

4 展望

細(xì)胞凋亡在股骨頭壞死發(fā)病過程中占有重要地位，是目前生命科學(xué)界熱門話題之一。細(xì)胞凋亡是受細(xì)胞內(nèi)源性基因、酶和信號傳導(dǎo)途徑調(diào)控的過程。鑒于骨細(xì)胞凋亡在股骨頭發(fā)生、發(fā)展機制中的重要地位，通過阻斷、干預(yù)凋亡進(jìn)行治療的策略逐步得到廣泛的接受。近年來，國內(nèi)外均已開展了多項抗凋亡治療的研究，主要針對細(xì)胞凋亡的誘發(fā)因素、激活通路和凋亡調(diào)控基因等。降脂[29]可使抗凋亡基因bcl-2和bcl-XL上調(diào)，從而達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡[30]，使我們在治療激素性股骨頭壞死上更進(jìn)一步。

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10.3969/j.issn.1672-5972.2014.04.012

swgk2014-05-0100

劉玉（1986-）男，碩士，在讀研究生，醫(yī)師，工作方向：骨外科。

*[通訊作者]趙建民（1965-）男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主任醫(yī)師。工作方向：骨外科。

2014-05-20）

國家自然科學(xué)基金資助項目（81360224）

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