李 濤 潘曉燕 陳海鳴 張 偉

納米細菌(nanobacteria,NB)是目前已知的最小的有細胞壁的細菌,它通過產(chǎn)生磷灰石結(jié)晶使體內(nèi)多種細胞發(fā)生病理性鈣化[1]。多項研究發(fā)現(xiàn)納米細菌與多種惡性腫瘤的鈣化有密切的關(guān)系[2-3],但尚未有明確研究報道乳腺癌微鈣化與納米細菌的關(guān)系。為此，我們采用ELASA法和免疫組化法研究納米細菌和乳腺癌微鈣化的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集上海市閘北區(qū)市北醫(yī)院和南昌大學第一附屬醫(yī)院2011年6月-2012年6月的乳腺疾病手術(shù)患者共110例，均為女性。依據(jù)良惡性及有無鈣化分為4組：A組為惡性伴鈣化組，30例，平均年齡55.6歲。B組：惡性無鈣化組，30例，平均年齡52.2歲。C組：良性伴鈣化，20例，平均年齡37.5歲。D組：良性無鈣化，30例，平均年齡31.2歲。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 分別采集上述患者的血清及病灶組織標本。

1.2.2 主要試劑 鼠抗納米細菌單克隆抗體8D10(10 μg/ml) 購自芬蘭Nanobac OY 公司,ELASA Kit 購自KPL公司，生物素化羊抗鼠IgG、ABC試劑盒、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德公司。

1.2.3 血清納米細菌感染的檢測 ELASA法：①將血清標本于-70 ℃解凍,取50～100 μl按1∶4用抗原包被液稀釋。②取100 μl包被液至各孔，4 ℃ 18～24 h或37 ℃孵育4 h，洗滌液洗3次，每次3 min(陽性對照按1∶25稀釋，每次設(shè)一陰性對照)。③加入封閉液每孔200 μl，37 ℃孵育1 h，洗滌液洗3次，每次3 min。④各孔加入鼠抗納米細菌單克隆抗體100 μl，37 ℃孵育1 h，洗滌液洗3次，每次3 min。⑤各孔加入羊抗小鼠IgG 100 μl，37 ℃孵育1 h，洗滌液洗3次，每次3 min，最后一遍浸泡5 min。⑥每孔加入100 μl底物復(fù)合液，37 ℃避光顯色至滿意，5～15 min后加入終止液50 μl，在20 min內(nèi)用酶標儀自動測定結(jié)果，波長405 nm。判斷標準：以測定標本孔的吸收值與一組陰性標本測定孔平均吸收值的比值大于2判斷為陽性。

1.2.4 組織納米細菌的檢測 免疫組化染色檢測，SABC法。判斷標準：在高倍視野下可見細胞質(zhì)內(nèi)或細胞外微小的棕黃色顆粒者為納米細菌感染的組織或細胞或納米細菌本身。

1.3 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)用SPSS11.0軟件分析，采用χ2檢驗。檢驗水準為α=0.05 。

2 結(jié)果

2.1 各組患者血清中納米細菌感染率

患者血清中納米細菌感染率A組73.3%(22/30)，B組10.0%(3/30)，C組5.0%(1/20)，D組6.7%(2/30)。A組與其他各組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，B、C、D組組間比較，差異均無統(tǒng)計學意義。

2.2 各組患者組織中納米細菌感染率

患者組織中納米細菌感染率A組93.3%(28/30)，B組13.3%(4/30)，C組5.0%(1/20)，D組0.0%(0/30)。A組與其他各組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，B組與C、D組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，C、D組組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

乳腺組織的鈣化是很常見的。在乳腺癌當中，伴有微鈣化的占40%～50%，良性疾病的鈣化也有約20%[4]。乳腺良惡性鈣化的成分和分布是不同的，惡性鈣化幾乎都為羥磷灰石，且腫瘤壞死區(qū)域最多。良性鈣化主要為草酸鈣，且多數(shù)不伴壞死，而草酸鈣只能由活性細胞分泌。本組資料也發(fā)現(xiàn)NB主要分布于惡性腫瘤的壞死區(qū)域，包括B組4例NB陽性的標本均是伴有明顯壞死。而良性的2組均不伴壞死。這些證據(jù)提示良惡性乳腺腫瘤鈣化的形成機制可能不同。

NB的1個重要特性就是它通過產(chǎn)生磷灰石結(jié)晶使體內(nèi)多種細胞發(fā)生病理性鈣化。目前的許多研究已證實它與多種鈣化性疾病密切相關(guān)，如泌尿系結(jié)石，膽道結(jié)石，動脈硬化等，并且與卵巢惡性腫瘤的砂粒體形成有關(guān)[2-3，5-6]。國內(nèi)唐中華等通過電鏡觀察20例乳腺癌標本，其中19例觀察到了納米細菌樣顆粒的存在[7]。本研究A組血清及組織中NB的感染率均明顯高于其他組，說明NB與乳腺癌鈣化有密切的關(guān)系。提示NB感染可能與乳腺癌微鈣化的形成有關(guān)，而與良性鈣化的形成無關(guān)。而惡性無鈣化組的感染率高于良性組我們認為可能是部分感染的病例是早期尚未形成鈣化灶。

對于乳腺癌微鈣化形成的具體機制目前尚不完全清楚，現(xiàn)有的主要觀點包括：①組織壞死或營養(yǎng)不良；②腫瘤細胞的分泌；③鈣泵或鈣調(diào)蛋白的功能失調(diào)；④壞死組織或細胞碎片的礦化等。這些觀點相互之間難以連貫。Ciftcioglu等研究發(fā)現(xiàn)許多惡性腫瘤都存在NB黏附受體，可以介導(dǎo)NB的進入，并且導(dǎo)致隨后腫瘤的鈣化，這一理論經(jīng)von Kossa染色證實[8]。NB的感染如果是乳腺癌微鈣化的關(guān)鍵因素，則有可能將上述的觀點很好的串聯(lián)起來：乳腺癌腫瘤細胞是否也會表達NB的粘附分子從而介導(dǎo)NB的進入，進而導(dǎo)致細胞鈣代謝失調(diào)，進一步造成組織壞死及微鈣化的形成。這一假設(shè)尚需進一步研究證實，但這為解釋乳腺癌微鈣化的形成機制提供了1個新的切入點。

對于某些早期無腫塊的乳腺癌，微鈣化往往是唯一的陽性發(fā)現(xiàn)。因此，微鈣化對于乳腺癌的早期診斷非常有意義。但判斷鈣化的良惡性是比較困難的。早先研究認為鈣化的大小，數(shù)目及分布有助于鑒別良惡性，這一觀點也被廣泛接受。但較近的多項研究發(fā)現(xiàn)上述的某些特征對于鑒別鈣化的良惡性意義不大，鈣化灶活檢不到30%的惡性檢出率也支持這些觀點[9-10]。本組資料顯示，惡性鈣化組伴有NB感染的比例明顯增高，特別是血清檢測感染的比例明顯增高，而且血清ELASA檢測簡便易行。因此，將NB血清感染作為1個輔助參考指標來明確鈣化的性質(zhì)理論上是可行的。如果進一步的研究能獲得證實，將有助于提高判斷鈣化良惡性的正確性，從而避免許多患者接受不必要的活檢。本組數(shù)據(jù)除A組外各組的血清NB感染率均低于國外報道14%的健康人群的感染率；B組血清感染率略高于國內(nèi)報道的健康人群8%的感染率，C、D兩組則稍低?？赡芘c良惡性兩組的平均年齡相差較大有關(guān)，國內(nèi)外的資料均提示隨著年齡的增加，NB感染的比例也會增高[11]。

文獻報道伴有鈣化的乳腺癌侵襲性強，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生明顯高于無鈣化的病例，預(yù)后相對較差[12]。張家云等也報道伴鈣化的乳腺癌患者合并HER-2陽性的比例明顯增加，病程多較晚[13]。這些均提示鈣化的形成可能與腫瘤的惡性程度及病程發(fā)展相關(guān)。Cooke等的研究顯示羥磷酸鹽不僅能刺激細胞的有絲分裂，加快腫瘤細胞的生長，而且能誘導(dǎo)癌細胞穿透基膜而發(fā)生轉(zhuǎn)移[14]。鈣代謝異?？赡苁前殁}化乳腺癌預(yù)后差的原因。NB是否在伴鈣化的乳腺癌的發(fā)展過程中扮演了重要的角色是個值得研究的方向，并且也可能為乳腺癌的治療提供了1個新的靶點。

[2] Kutikhin AG,Brusina EB,Yuzhalin AE.The role of calcifying nanoparticles in biology and medicine〔J〕.Int J Nanomedicine，2012，7：339-350.

[3] Hudelist TG,Singel CF,Kubista E.Presence of nanobacteria in psammoma bodies of ovarian cancer：evidence for pathogenetic role in intratumoral biomineralization〔J〕.Histopathology,2004,45(6)：633-637.

[4] Morgan MP,Cooke MM,McCarthy GM.Microcalcifications associated with breast cancer：an epiphenomenon or biologically significant feature of selected tumors?〔J〕.J Mammary Gland Biol Neoplasia，2005，10(2)：181-187.

[5] Kumon H,Matsumoto A,Uehara S,et al.Detection and isolation of nanobacteria-like particles from urinary stones：long-withheld data〔J〕.Int J Urol，2011，18(6)：458-465.

[6] Tulunay Kaya C,Sinan Ertas F,Hasan T,et al.Anticalcifying nanoparticle antibody titer is an independent risk factor for coronary artery calcification〔J〕.Coron Artery Dis，2011，22(6)：394-400.

[7] 唐中華,吳 唯,呂新生,等.乳腺癌組織中NB 樣顆粒的電鏡觀察〔J〕.醫(yī)學臨床研究,2002,19(3)：214-215.

[8] Ciftcioglu N,Kajander EO.Interaction of nanobacteria with cultured mammalian cells〔J〕.Pathophysiology,1998,4(4)：259-270.

[9] Baker R,Rogers KD,Shepherd N,et al.New relationships between breast microcalcifications and cancer〔J〕.Br J Cancer,2010,103(7)：1034-1039.

[10] 陳國際，張保寧，王仲照,等.乳腺微小鈣化定位切除的臨床應(yīng)用〔J〕.實用癌癥雜志，2006，21(2)：165-166,172.

[11] 王學軍，劉 威，楊竹林，等.部分健康成年人群血清中納米細菌感染的調(diào)查〔J〕.中華流行病學雜志，2004,25(6)：492-494.

[12] Rominger M,Wisgickl C,Timmesfeld N.Breast microcalcifications as type descriptors to stratify risk of malignancy：a systematic review and meta-analysis of 10665 cases with special focus on round/punctate microcalcifications〔J〕.Rofo，2012，184(12)：1144-1152.

[13] 張家云，林文健.乳腺浸潤性導(dǎo)管癌鉬靶X線鈣化與C-erbB-2表達的關(guān)系〔J〕.實用癌癥雜志，2010,25(7)：364-365.

[14] Cooke M,McCarthy GM,Sallis JD,et al.Phosphocitrate inhibits calcium hydroxyapatite induced mitogenesis and upregulation of matrix metalloproteinase-1,interleukin-1,and cyclooxygenase-2 mRNA in human breast cancer cell lines〔J〕.Breast Cancer Res Treat，2003,79(2)：253-263.