關亞鵬，婁　忻，張　莉，張雪霞，時　蕾

(華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責任公司 微生物藥物國家工程研究中心河北省工業(yè)微生物代謝工程技術研究中心，河北 石家莊 050015)

硒元素具有重要的生理功能，作為一種人體必需的微量元素已經(jīng)引起人們的高度重視。人體缺硒會導致癌癥、心肌梗塞等多種重大疾病，而天然食品中的硒含量普遍較低[1-2]。目前，補充硒的方式主要有兩種：無機硒和有機硒。無機硒主要以亞硒酸鈉為主，但其毒性遠大于有機硒，而酵母本身的營養(yǎng)豐富，且轉化無機硒的能力也很強，所以通過富硒酵母補充硒元素是一種安全有效的途徑[3-5]。

目前，國內關于富硒酵母誘變方法的研究比較多，如采用紫外誘變、硫酸乙二酯(DES)誘變、60Co-γ射線輻照等物理和化學方法[6-8]。近年來，氦氖激光誘變在微生物遺傳育種方面的應用越來越多。氦氖激光誘變機理尚不明確，可能的原因是激光的穿透作用使細胞內的一些重要物質發(fā)生不可逆的變化，導致細胞內各種代謝機制紊亂，代謝過程受阻，表現(xiàn)為細胞分裂遲緩或死亡[9-10]。作者在此采用紫外誘變結合氦氖激光輻照誘變方法篩選到了一株高產(chǎn)富硒酵母。

1　實驗

1.1　菌種、培養(yǎng)基與儀器

釀酒酵母FX-12-135，自行保存。

分離培養(yǎng)基：葡萄糖，蛋白胨，酵母粉，瓊脂。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖，酵母粉等。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖，蛋白胨，酵母粉。

紫外燈(30 W)；He-Ne-1000型氦氖激光儀。

1.2　誘變方法

1.2.1菌懸液的制備

將初始菌種成熟斜面加入無菌水，刮下菌體，經(jīng)振蕩、玻璃珠打散，過濾后制成菌懸液，逐級稀釋至適宜濃度，待用。

1.2.2紫外誘變處理

將菌懸液置于平皿中，在距離紫外燈32 cm處進行30～180 s的照射處理，時間間隔為30 s。將照射后的菌懸液稀釋到一定濃度，涂布于固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選菌落，進行初篩和搖瓶篩選，以未經(jīng)紫外線照射的菌液作為對照，計算致死率；根據(jù)搖瓶篩選結果計算正突變率，正突變率以富硒水平高于出發(fā)菌種水平的突變株數(shù)量計算。

1.2.3氦氖激光誘變處理

取適量菌懸液置于無菌的石英小皿中進行氦氖激光(功率18 mW，距離20 cm)輻照，輻照時間分別為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min；將處理菌液稀釋至合適濃度，取適量涂布于固體平板上，28 ℃培養(yǎng)2 d，待菌落成熟后進行菌落初篩和搖瓶篩選，根據(jù)搖瓶篩選結果計算菌種的正突變率。

1.3　初篩和搖瓶篩選

以菌落大小和菌落形態(tài)作為篩選指標，挑選生長快、直徑較大的單菌落轉接于正常固體平板(不含硒)和含硒(300 μg·g-1)平板上，并做好標記，位置一一對應。單菌落培養(yǎng)2 d后，選取在含硒平板上長勢良好、顏色微紅的單菌落對應的正常固體培養(yǎng)基上的單菌落傳斜面培養(yǎng)。然后進行搖瓶復篩，發(fā)酵過程中補加一定量的亞硒酸鈉，發(fā)酵結束測定有機硒含量。

1.4　干酵母的制備

取一定量搖瓶發(fā)酵液，在3 000 r·min-1條件下離心10 min，去上清，加入一定量蒸餾水，洗滌、離心菌體，反復操作3次，得到新鮮酵母，于80 ℃烤箱內干燥6 h，即得到干酵母。

1.5　硒含量的測定[11]

采用3，3-二氨基聯(lián)苯胺比色法測定酵母中有機硒含量(μg·g-1)。

2　結果與討論

2.1　紫外誘變突變株的篩選

初始菌株FX-12-135經(jīng)不同時間紫外誘變后的致死率和正負突變率見表1。

表1紫外誘變時間對初始菌種FX-12-135生長的影響

Tab.1EffectsofUVmutationtimeongrowthoforiginalstrainFX-12-135

紫外誘變時間/s致死率/%正突變率/%負突變率/%303115896604956513190627811571208861331091509691149218099833118

由表1可見，隨著紫外誘變時間的延長，菌株的致死率逐漸上升；當紫外誘變時間為120 s時，菌株的致死率比較適宜，正突變率最高，達到了13.3%；當誘變時間為180 s時，菌株的致死率接近100%，正突變率很低。因此，確定最佳紫外誘變時間為120 s。

初始菌株FX-12-135的菌懸液經(jīng)紫外照射120 s后涂布平板，挑選155個培養(yǎng)成熟的單菌落進行菌落初篩和搖瓶篩選，得到21支相對高富硒菌株，挑選其中10支高產(chǎn)菌株進行復試驗證，得到菌株UV-13-62，經(jīng)3批搖瓶復試驗證其富集有機硒能力比出發(fā)菌株提高11.6%。

2.2　氦氖激光誘變突變株的篩選

將紫外誘變得到的菌株UV-13-62斜面制成菌懸液，經(jīng)不同時間的氦氖激光輻照后，搖瓶篩選計算菌株的正突變率。氦氖激光輻照時間對菌株UV-13-62生長的影響見圖1。

圖1　氦氖激光輻照時間對菌株UV-13-62生長的影響

由圖1可見，在20～60 min時菌株的正突變率隨著氦氖激光輻照時間的延長而增大；輻照時間為60 min時，正突變率最高；超過60 min后，正突變率下降。因此，確定氦氖激光最佳輻照時間為60 min。

選取氦氖激光輻照60 min的219個單菌落培養(yǎng)2 d，進行菌落初篩和搖瓶篩選，得到36支正突變菌株，挑選富硒水平高于出發(fā)菌株UV-13-62 10%以上的15支菌株進行3批搖瓶復試，以有機硒含量為篩選指標，篩選得到了一株高產(chǎn)菌株HN-14-109，其富集有機硒能力比UV-13-62提高16.3%，比初始菌株FX-12-135累計提高29.8%。

2.3　復合誘變突變株遺傳穩(wěn)定性研究

對菌株HN-14-109連續(xù)傳代3次，4代斜面同時進行搖瓶發(fā)酵，考察其遺傳穩(wěn)定性，結果見表2。

表2菌株HN-14-109的遺傳穩(wěn)定性

Tab.2GeneticstabilityofstrainHN-14-109

傳代數(shù)F1F2F3F4相對硒含量/%100010261015983

由表2可看出，4代斜面菌株發(fā)酵后的有機硒含量波動不大，說明菌株HN-14-109沒有發(fā)生回復突變，具有比較穩(wěn)定的遺傳特性。

3　結論

以釀酒酵母FX-12-135為初始菌株，以有機硒含量為篩選指標，篩選高產(chǎn)富硒酵母菌。首先采用紫外誘變方法處理菌株，然后利用氦氖激光輻照處理進行選育,得到一株高產(chǎn)突變株HN-14-109，其搖瓶富硒能力比初始菌株提高29.8%，且遺傳特性穩(wěn)定。表明紫外誘變復合氦氖激光輻照是提高酵母富硒能力的有效方法。

參考文獻：

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