張 麗，李文桂，譚建蓉

日本血吸蟲(chóng)病是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的人獸共患寄生蟲(chóng)病，其主要流行于中國(guó)和菲律賓等國(guó)，給流行區(qū)的人民身體健康及經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成嚴(yán)重影響。血吸蟲(chóng)病防治的最大難點(diǎn)在于再感染難以阻斷，疫苗研究已成為學(xué)者公認(rèn)的血吸蟲(chóng)防治的補(bǔ)充措施。脾臟是人體外周最大的免疫器官，其不僅是各種免疫細(xì)胞(B細(xì)胞、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等)定居的場(chǎng)所，更是初次免疫應(yīng)答(體液和細(xì)胞免疫)和再次免疫應(yīng)答的場(chǎng)所，因此脾臟細(xì)胞學(xué)的改變與機(jī)體的免疫狀態(tài)息息相關(guān)。本研究在成功構(gòu)建日本血吸蟲(chóng)重組Bb(pGEX-Sj26GST)疫苗的基礎(chǔ)上，動(dòng)態(tài)觀(guān)察疫苗在不同時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)的BALB/c鼠脾細(xì)胞增殖、亞群和凋亡水平，以期為該疫苗的保護(hù)性免疫機(jī)制研究提供有意義的材料。

1 材料與方法

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及免疫方案 96只20～25 g,12～14周齡清潔級(jí)雌性BALB/c鼠購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將小鼠隨機(jī)分為兩組，每組48只，鼻腔黏膜接種組(IN):每只小鼠單次鼻腔粘膜接種105克隆形成單位(colony forming unit,CFU)/10 μL疫苗；皮下注射組(SC)：每只小鼠單次皮下注射106CFU/100 μL疫苗，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束均無(wú)小鼠死亡。

1.3脾細(xì)胞的制備 免疫后0～20周，兩組各隨機(jī)剖殺4只小鼠，無(wú)菌取脾置200目尼龍網(wǎng)磨碎，用1 mL 0.85%的生理鹽水沖洗，濾液置10 mL離心管中，加入4 mL雙蒸水使?jié)B透壓降至0.15%以溶解紅細(xì)胞，再加入1.34 mL 3.6%的生理鹽水使其恢復(fù)等滲，用0.85%生理鹽水沖洗兩次，3 000 r/min(離心半徑11 cm)離心10 min，去上清，加入10 mL 0.85%的生理鹽水混勻，調(diào)制細(xì)胞數(shù)為5×106/mL，上述相同條件離心，棄上清，加入10 mL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，再加入青霉素(1 000 U/mL)及鏈霉素(10 mg/mL)各100 μL混勻。

1.4脾細(xì)胞增殖的檢測(cè) 將上述調(diào)制好濃度的脾細(xì)胞加入24孔培養(yǎng)板，每個(gè)標(biāo)本設(shè)3孔，分別加入1 mL原液、1 mL原液+10 μg的SjAWA和1 mL原液+10 μg的ConA，再加入5 μg/mL的MTT 10 μL/孔，混勻，置37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)18 h，棄上清150 μL/孔后，加入DMSO 150 μL/孔，反復(fù)吹打使形成的甲臜充分溶解后，于570 nm處檢測(cè)OD值。

1.6Annexin V-FITC染色法檢測(cè)脾細(xì)胞凋亡 上述脾細(xì)胞加入24孔細(xì)胞計(jì)數(shù)培養(yǎng)板，每個(gè)標(biāo)本設(shè)置兩組，分別加入700 μL原液及700 μL原液和10 μg ConA的混合物，于37 ℃、5%的CO2孵箱中培養(yǎng)16～18 h。收集培養(yǎng)板中的脾細(xì)胞于1.5 mL的EP管中，3 000 r/min(離心半徑11.5 cm)離心3 min，加入4 ℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)1 mL混勻，3 000 r/min離心3min，重復(fù)1次，加入250 mL的結(jié)合緩沖液充分混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，加入20 μg/mL的碘化丙啶溶液(PI)10 μL及Annexin V-FITC 5 μL混勻，室溫避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀記錄FITC標(biāo)記的凋亡細(xì)胞在波長(zhǎng)為495 nm紫外光激發(fā)下產(chǎn)生的525 nm的綠色熒光劑PI標(biāo)記的凋亡及壞死細(xì)胞在波長(zhǎng)為340 nm紫外光激發(fā)下產(chǎn)生的620 nm的紅色熒光，CellQuet軟件分析細(xì)胞凋亡。

2 結(jié) 果

2.1脾細(xì)胞增殖 未刺激及SjAWA刺激時(shí)SC組小鼠脾細(xì)胞增殖水平于免疫后4～20周明顯升高，ConA刺激時(shí)于4～18周升高顯著，均于免疫后8周達(dá)最高水平(與0周比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05或0.01)；IN組中原液組于2～18周升高，SjAWA刺激組在2～10周及14～18周升高，ConA刺激組于2～8周及12～18周升高，均于免疫后4周達(dá)最高水平(與0周比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05或0.01)；同一時(shí)間點(diǎn)兩組ConA組顯著高于相應(yīng)的SjAWA組，SjAWA組明顯高于相應(yīng)的原液組(P<0.05或0.01)；兩種免疫途徑無(wú)明顯差異，但I(xiàn)N組早于SC組達(dá)最大值(表1)。

WeekNo.miceOD570 valueSC groupIN groupUndilutedsolutionSjAWA ConAUndilutedsolutionSjAWA ConA040.111±0.0010.131±0.0010.153±0.0020.111±0.0010.131±0.0010.153±0.002240.128±0.0060.148±0.0060.168±0.0050.163±0.010?0.184±0.009?0.208±0.011440.153±0.005△0.173±0.005△0.194±0.005△0.176±0.012?0.197±0.012?0.219±0.012△640.161±0.005△0.181±0.005△0.209±0.005△0.167±0.003△0.189±0.003△0.210±0.003△840.179±0.004△0.201±0.004△0.223±0.006△0.151±0.001△0.173±0.001△0.198±0.001△1040.136±0.004△0.159±0.005△0.181±0.004△0.140±0.001△0.160±0.002△0.177±0.008△1240.135±0.001△0.156±0.002△0.177±0.002△0.130±0.003?0.146±0.0130.169±0.001△1440.129±0.001△0.149±0.002△0.173±0.003△0.126±0.002△0.145±0.004?0.168±0.001△1640.125±0.001△0.146±0.001△0.168±0.001△0.122±0.001△0.143±0.002△0.164±0.001△1840.122±0.001△0.143±0.001△0.165±0.003?0.123±0.001△0.143±0.001△0.165±0.001?2040.118±0.002?0.138±0.002?0.159±0.0100.121±0.0040.140±0.0030.161±0.023

Note: vs.0 week,*P<0.05,△P<0.01.

2.3脾細(xì)胞凋亡 未刺激和ConA刺激時(shí)SC組脾細(xì)胞凋亡水平分別于免疫后2～4周、2～6周升高顯著，均于免疫后2周達(dá)最大值(P<0.01或P<0.05)；IN組均于4周顯著升高并達(dá)峰值(P<0.01)。同一時(shí)間點(diǎn)兩組ConA組脾細(xì)胞凋亡水平均高于相應(yīng)的原液組(P<0.01)，兩種免疫途徑無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但SC組先于IN組達(dá)最峰值(表3)。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)與抵抗再感染相關(guān)[1],提示脾細(xì)胞的增殖、分化在宿主免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)方面具有重要作用,測(cè)定脾淋巴細(xì)胞增殖能力可作為反映免疫能力的一個(gè)重要指標(biāo)。趙晶晶等[2]發(fā)現(xiàn)，BALB/c小鼠感染日本血吸蟲(chóng)后6～8周，脾臟體積增大，質(zhì)量增加，淋巴細(xì)胞數(shù)目也明顯增多，提示日本血吸蟲(chóng)感染，將導(dǎo)致宿主脾細(xì)胞增殖，發(fā)揮保護(hù)性免疫效應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)SC組小鼠脾細(xì)胞水平于免疫后4周開(kāi)始明顯升高，并于8周達(dá)峰值，而IN組從免疫后2周開(kāi)始顯著升高，于4周達(dá)最高值，表明該疫苗在早期即可誘導(dǎo)脾細(xì)胞增殖反應(yīng)；且同一時(shí)間點(diǎn)SjAWA和ConA刺激組脾細(xì)胞增殖水平均高于相應(yīng)的原液組，而ConA刺激組高于SjAWA組，可能因?yàn)镾jAWA為特異性刺激物，而ConA能非特異性的促進(jìn)所有淋巴細(xì)胞的增殖；提示該疫苗可誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫。

WeekNo.miceSC groupIN groupCD+4T CD+8T CD+4T CD+8T040.217±0.0010.072±0.0010.217±0.0010.072±0.001240.227±0.001△0.077±0.001?0.238±0.005?0.073±0.002440.236±0.002△0.076±0.0010.242±0.0070.077±0.002640.266±0.001△0.076±0.0060.276±0.006△0.079±0.003840.309±0.004△0.078±0.001?0.304±0.014?0.078±0.0031040.290±0.001△0.075±0.0040.272±0.014?0.074±0.0031240.277±0.003△0.076±0.0020.258±0.003△0.075±0.0011440.236±0.001△0.074±0.0020.247±0.005△0.073±0.0021640.225±0.0090.074±0.0030.229±0.002△0.073±0.0041840.223±0.0050.074±0.0010.221±0.0050.073±0.0032040.217±0.0020.073±0.0020.217±0.0020.075±0.003

Note: vs.0 week,*P<0.05,△P<0.01.

WeekNo.miceSCGroup INGroupUndiluted solutionConA group Undiluted solution ConA group040.027±0.0000.051±0.0010.027±0.0000.051±0.001240.087±0.002△0.112±0.003△0.027±0.0010.048±0.002440.076±0.009?0.104±0.007△0.087±0.005△0.107±0.005△640.031±0.0020.053±0.000△0.036±0.0060.056±0.006840.029±0.0010.051±0.0010.029±0.0030.050±0.0021040.028±0.0020.050±0.0020.029±0.0030.051±0.0031240.027±0.0030.049±0.0030.028±0.0010.049±0.0011440.027±0.0010.049±0.0010.025±0.0000.047±0.0011640.027±0.0010.049±0.0010.026±0.0020.048±0.0021840.027±0.0000.049±0.0000.026±0.0010.048±0.0012040.027±0.0010.049±0.0010.026±0.0010.047±0.002

Note: vs.0 week,*P<0.05,△P<0.01.

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