亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        口蹄疫病毒致乳鼠心肌炎的動(dòng)物模型

        2014-04-02 05:34:06張克山何繼軍吳佳俊劉永杰成偉偉尚佑軍劉湘濤才學(xué)鵬
        關(guān)鍵詞:乳鼠透射電鏡肌纖維

        張克山,何繼軍,吳佳俊,劉永杰,成偉偉,尚佑軍,劉湘濤,才學(xué)鵬

        口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)感染引起的偶蹄動(dòng)物的一種烈性傳染病[1],F(xiàn)MDV包含7個(gè)血清型,其作為一類動(dòng)物傳染病,給我國(guó)畜牧業(yè)健康發(fā)展和人們身體健康造成巨大威脅[2]。FMDV除引起偶蹄動(dòng)物蹄、唇部水泡外還可引起幼畜的急性死亡,其致哺乳幼畜死亡的最主要原因是急性心肌炎,F(xiàn)MDV感染幼畜心臟致使心肌變性、壞死而出現(xiàn)灰白色或淡灰色斑點(diǎn)和條紋(又稱虎斑心),多不表現(xiàn)出FMD特有的臨床癥狀而急性死亡[3]。在獸醫(yī)臨床上常見哺乳仔豬因FMDV感染導(dǎo)致急性心肌炎而大批死亡[4]。近年來(lái)育肥豬(或牛)因感染FMDV導(dǎo)致心肌炎而出現(xiàn)的急性死亡病例有迅速抬頭之勢(shì), FMDV引起羔羊心肌炎而急性死亡也曾有報(bào)道[5]。乳鼠作為對(duì)FMDV較為敏感的動(dòng)物,常被用來(lái)FMDV的分離培養(yǎng)、血清型鑒定和毒力測(cè)定[6-8]。目前對(duì)于FMDV引起心肌炎分子機(jī)制的研究越來(lái)越受到重視,研究發(fā)現(xiàn)肌鈣蛋白Ⅰ在羊血清中可作為FMDV引起心肌炎的生物標(biāo)志[9]。動(dòng)物模型的建立是FMDV致心肌炎研究中最重要也是最基礎(chǔ)的一個(gè)環(huán)節(jié),但目前還沒(méi)有很好的用來(lái)研究FMDV心肌炎的動(dòng)物模型。本文建立了FMDV感染乳鼠心肌炎動(dòng)物模型,為FMDV致心肌炎分子機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1乳鼠及病毒接種 3日齡SPF BALB/c乳鼠12只,隨機(jī)分成兩組,6只/組,乳鼠和母鼠一同飼養(yǎng)。A型FMDV病毒來(lái)源于國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞適應(yīng)毒,其毒價(jià)TCID50為106.5,實(shí)驗(yàn)組6只乳鼠全部頸部皮下注射含有105.5TCID50A型FMDV的PBS 100 μL,對(duì)照組6只乳鼠全部頸部皮下接種PBS 100 μL。連續(xù)觀察36 h,取頻臨死亡的實(shí)驗(yàn)組乳鼠和同一時(shí)間的對(duì)照組乳鼠心臟,剪開用滅菌PBS沖洗干凈后,同一乳鼠心臟一分為二分別浸泡于甲醛和戊二醛溶液,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2乳鼠心臟H.E染色觀察 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組乳鼠心臟經(jīng)甲醛固定后切割成薄片, 經(jīng)常規(guī)蘇木精-伊紅(H.E)染色封片后顯微鏡下觀察變化。

        1.3乳鼠心肌透射電鏡顯微觀察 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組乳鼠心臟浸泡于用PBS配置成的3%的戊二醛溶液中,經(jīng)過(guò)4 ℃固定、預(yù)處理、包埋和切片后放置于JEM-400cx透射電鏡下觀察顯微結(jié)構(gòu)變化。

        1.4乳鼠心肌內(nèi)FMDV特異性基因擴(kuò)增 參考GenBank公布的FMDV基因序列(JF792355.1),設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增FMDV VP1基因,上游引物5′- GGC AAG GAC TTT GAG TT,下游引物5′- GCG GTC TTG TGT GGT GTC - 3′ 。分別取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組乳鼠心肌1~3 g,加入適量PBS研磨成10%的懸液, 5 000 r/min離心10 min后取上清,RNA快速提取試劑盒提取總RNA,RT-PCR反應(yīng)體系為:RNase Free ddH2O 15 μL,10×RT buffer 5 μL,MgCl210 μL,dNTPs(10 mmol/L) 5 μL,RNase Inhibitor 1 μL,AMV Reverse Transcriptase 1 μL,AMV-Optimized Taq(5U/μL) 1 μL,上游引物1 μL,下游引物 1 μL,Template RNA 10 μL。反應(yīng)條件為:50 ℃ 35 min;99 ℃ 5 min;進(jìn)入PCR程序?yàn)?4 ℃變性30 s 56.5 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min共計(jì)35個(gè)循環(huán),循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束取RT-PCR反應(yīng)液5~10 μL,0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),然后進(jìn)行序列測(cè)定分析。

        2 結(jié) 果

        2.1接種FMDV后乳鼠觀察 FMDV攻毒后36 h,接種PBS對(duì)照組的乳鼠皮膚紅潤(rùn),反應(yīng)靈敏,精神狀態(tài)良好(圖1A),而感染組乳鼠皮膚暗淡無(wú)光,反應(yīng)遲鈍,四肢僵硬,頻臨死亡(圖1B)。

        圖1FMDV接種后乳鼠觀察

        Fig.1ObservationofsucklingmiceafterFMDVinfection

        A: Mouse in negative control group; B: Mouse in experimental group.

        2.2乳鼠心肌H.E染色觀察 實(shí)驗(yàn)組乳鼠接種FMDV后36 h H.E染色可見心肌纖維水腫且纖維結(jié)構(gòu)不完整,間質(zhì)充血,中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2A),而對(duì)照組乳鼠心肌纖維完整,間質(zhì)、血管等結(jié)構(gòu)均正常清晰(圖2B)。

        2.3乳鼠心肌電鏡觀察 經(jīng)透射電鏡觀察可見對(duì)照組乳鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰,肌纖維排列整齊,肌節(jié)結(jié)構(gòu)正常(圖3A),感染組接種FMDV后36 h可見大量心肌細(xì)胞線粒體腫脹,心肌纖維溶解,肌纖維結(jié)構(gòu)不完整(圖3B)。

        2.4目的基因擴(kuò)增 感染組6只乳鼠,每只乳鼠心肌中均可擴(kuò)增出FMDV 特異性目的基因VP1(圖4 Lane 1-6),而對(duì)照組未擴(kuò)增出FMDV特異性目的基因(圖4 Lane 7)。擴(kuò)增出的目的基因經(jīng)序列測(cè)定分析,為FMDV特有的VP1基因序列。

        圖2FMDV感染后乳鼠心肌病理切片H.E染色(400×)

        Fig.2PathologicsliceofsucklingmicecardiacmusclebyH&Estain(400×)

        A: Myocardium of mice in experimental group;

        B: Myocardium of mice in negative control group.

        圖3FMDV感染后乳鼠心肌透射電鏡觀察(6000×)

        Fig.3ObservationofsucklingmicecardiacmuscleunderTEM(6000×)

        A:Myocardium of mice in negative control group; B: Myocardium of mice in experimental group.

        圖4乳鼠心肌中FMDVVP1基因擴(kuò)增

        Fig.4Geneamplificationfromsucklingmicecardiacmuscle

        1-6: FMDV detection from myocardium of mice in experimental group; 7: FMDV detection from myocardium of mice in control group; M: DNA ladder 2000.

        3 討 論

        病毒性心肌炎是由病毒感染引起的心肌間質(zhì)和(或)實(shí)質(zhì)的彌漫性或局限性病變,表現(xiàn)為心肌細(xì)胞損傷,心肌細(xì)胞變性[10]和心肌纖維之間和血管周圍結(jié)締組織中大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。人們對(duì)口蹄疫的關(guān)注往往局限于唇部水泡或者蹄冠部水泡或者坡行[11],很少關(guān)注該病毒引起的心肌炎。實(shí)際生產(chǎn)中常見FMDV感染致哺乳幼齡動(dòng)物死亡或者出現(xiàn)青壯年動(dòng)物死亡的病例,這主要是FMDV感染引起急性心肌炎的結(jié)果。目前已知的心肌炎發(fā)病機(jī)制有基因表達(dá)調(diào)控,免疫反應(yīng)[12],病毒直接作用,心肌纖維化,心肌能量代謝障礙和細(xì)胞凋亡等。感染初期可見病毒引起的心肌細(xì)胞溶解,伴有體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞破壞未感染的心肌細(xì)胞,造成嚴(yán)重的心肌損害[13],病毒特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞引起被感染的心肌纖維溶解。

        本文以3日齡乳鼠為研究對(duì)象,接種FMDV后觀察其死亡和心肌炎表現(xiàn),經(jīng)H.E染色和透射電鏡觀察,看到明顯的FMDV感染組乳鼠心肌出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和心肌纖維溶解,感染組乳鼠心肌內(nèi)檢測(cè)到FMDV的存在,進(jìn)一步證實(shí)了該變化是由FMDV感染引起的。為安全起見,本試驗(yàn)所有操作均在國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室P3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。該動(dòng)物模型的建立為進(jìn)一步研究FMDV致動(dòng)物心肌炎的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ),下一步的工作將是尋找FMDV感染后炎性心肌細(xì)胞和正常心肌細(xì)胞之間的蛋白質(zhì)組學(xué)差異,鑒定、分析并驗(yàn)證這些差異蛋白在乳鼠心肌炎發(fā)病過(guò)程中所扮演的角色。

        參考文獻(xiàn):

        [1]Grubman MJ, Baxt B. Foot-and-mouth disease[J]. Clin Microbiol Rev, 2004, 17: 465-493.DOI: 10.1128/CMR.17.2.465-493.2004

        [2]Mason PW, Grubman MJ, Baxt B. Molecular basis of pathogenesis of FMDV[J]. Virus Res, 2003, 91: 9-32. DOI: 10.1016/S0168-1702(02)00257-5

        [3]Ryan E, Horsington J, Durand S, et al. Foot-and-mouth disease virus infection in young lambs: pathogenesis and tissue tropism[J]. Vet Microbiol, 2008, 127: 258-274. DOI: 10.1016/j.vetmic.2007.08.029

        [4]Donaldson AI, Ferris NP, Wells GA. Experimental foot-and-mouth disease in fattening pigs, sows and piglets in relation to outbreaks in the field[J]. Vet Res, 1984, 115: 509-512. DOI: 10.11366/ vr.115.20.509

        [5]Tunca R, Sozmen M, Erdogan H, et al. Determination of cardiac troponin I in the blood and heart of calves with foot-and-mouth disease[J]. J Vet Diagn Invest, 2008, 20: 598-605.DOI: 10.1177/104063870802000510

        [6]Chen W, Yan W, Du Q, et al. RNA interference targeting VP1 inhibits foot-and-mouth disease virus replication in BHK-21 cells and suckling mice[J]. J Virol, 2004, 78: 6900-6907.DOI: 10.1128/JVI.78.13.6900-6907.2004

        [7]Baranowski E, Molina N, Nunez JI, et al. Recovery of infectious foot-and-mouth disease virus from suckling mice after direct inoculation with in vitro-transcribed RNA[J]. J Virol, 2003, 77: 11290-11295. DOI: 10.1128/JVI.77.20.11290-11295.2003

        [8]Cong W, Cui S, Chen J, et al. Construction of a multiple targeting RNAi plasmid that inhibits target gene expression and FMDV replication in BHK-21 cells and suckling mice[J]. Vet Res Commun, 2010, 34: 335-346. DOI: 10.1007/s11259-010-9360-y

        [9]Gulbahar MY, Davis WC, Guvenc T, et al. Myocarditis associated with foot-and-mouth disease virus type O in lambs[J]. Vet Pathol, 2007, 44: 589-599. DOI: 10.1354/vp.44-5-589

        [10]Yajima T, Knowlton KU. Viral myocarditis from the perspective of the virus[J]. Circulation, 2009, 119: 2615-2624. DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.108.766022

        [11]Alexandersen S, Mowat N. Foot-and-mouth disease: host range and pathogenesis[J]. Curr Top Micro Immu, 2005, 288: 9-42.

        [12]Barin JG, Talor MV, Baldeviano GC, et al. Mechanisms of IFN-γ regulation of autoimmune myocarditis[J]. Exp Mol Pathol, 2010, 89(2): 83-91. DOI: 10.1016/j.yexmp.2010.06.005

        [13]Feldman AM, McNamara D. Myocarditis[J]. New Engl J Med, 2000, 343: 1388-1398. DOI: 10.1056/NEJM200011093431908

        猜你喜歡
        乳鼠透射電鏡肌纖維
        乳腺炎性肌纖維母細(xì)胞瘤影像學(xué)表現(xiàn)1例
        嬰兒顱骨肌纖維瘤/肌纖維瘤病2例
        頂骨炎性肌纖維母細(xì)胞瘤一例
        電子顯微學(xué)專業(yè)課的透射電鏡樣品制備實(shí)習(xí)課
        改良無(wú)血清法培養(yǎng)新生SD乳鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞
        透射電子顯微鏡在實(shí)驗(yàn)教學(xué)研究中的應(yīng)用
        山東化工(2020年15期)2020-02-16 01:00:12
        基于大數(shù)據(jù)的透射電鏡開放共享實(shí)踐與探索
        透射電鏡中正空間—倒空間轉(zhuǎn)換教學(xué)探討
        microRNA-139對(duì)小鼠失神經(jīng)肌肉萎縮中肌纖維的影響
        苦參素對(duì)缺氧/復(fù)氧損傷乳鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的影響
        亚洲成a∨人片在线观看无码| 特黄熟妇丰满人妻无码| 亚洲色婷婷一区二区三区| 久草视频国产| 日本精品极品视频在线| 亚洲国产系列一区二区| 亚洲一区自拍高清亚洲精品| 欧美精品偷自拍另类在线观看| 国产欧美亚洲精品第二区首页 | 午夜福利理论片在线观看| 美女大量吞精在线观看456| 国产美女精品AⅤ在线老女人| 国产精品自拍盗摄自拍| 国产精品538一区二区在线| 无码专区久久综合久中文字幕| 久久亚洲精彩无码天堂| 色和尚色视频在线看网站| 亚洲成av人影院| 国产啪精品视频网给免丝袜| 国产美女主播福利一区| 日韩中文字幕版区一区二区三区| 疯狂撞击丝袜人妻| 538任你爽精品视频国产| 国产女主播一区二区三区在线观看| 脱了老师内裤猛烈进入| 日日鲁鲁鲁夜夜爽爽狠狠视频97| 99热这里只有精品久久6| 全亚洲高清视频在线观看| 精品少妇无码av无码专区| 久久久久久久中文字幕| 免费黄网站永久地址进入| 欧美大胆性生话| 色老汉免费网站免费视频| 中文字幕在线一区乱码| 国产亚洲精品97在线视频一| 成人免费毛片aaaaaa片| 人妻中出精品久久久一区二| 中文字幕亚洲五月综合婷久狠狠| 久久国产色av免费观看| 国产精品公开免费视频| 中国av一区二区三区四区|