張克山，何繼軍，吳佳俊，劉永杰，成偉偉，尚佑軍，劉湘濤，才學(xué)鵬

口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)感染引起的偶蹄動(dòng)物的一種烈性傳染病[1]，F(xiàn)MDV包含7個(gè)血清型，其作為一類動(dòng)物傳染病，給我國(guó)畜牧業(yè)健康發(fā)展和人們身體健康造成巨大威脅[2]。FMDV除引起偶蹄動(dòng)物蹄、唇部水泡外還可引起幼畜的急性死亡，其致哺乳幼畜死亡的最主要原因是急性心肌炎，F(xiàn)MDV感染幼畜心臟致使心肌變性、壞死而出現(xiàn)灰白色或淡灰色斑點(diǎn)和條紋(又稱虎斑心)，多不表現(xiàn)出FMD特有的臨床癥狀而急性死亡[3]。在獸醫(yī)臨床上常見哺乳仔豬因FMDV感染導(dǎo)致急性心肌炎而大批死亡[4]。近年來(lái)育肥豬(或牛)因感染FMDV導(dǎo)致心肌炎而出現(xiàn)的急性死亡病例有迅速抬頭之勢(shì), FMDV引起羔羊心肌炎而急性死亡也曾有報(bào)道[5]。乳鼠作為對(duì)FMDV較為敏感的動(dòng)物，常被用來(lái)FMDV的分離培養(yǎng)、血清型鑒定和毒力測(cè)定[6-8]。目前對(duì)于FMDV引起心肌炎分子機(jī)制的研究越來(lái)越受到重視，研究發(fā)現(xiàn)肌鈣蛋白Ⅰ在羊血清中可作為FMDV引起心肌炎的生物標(biāo)志[9]。動(dòng)物模型的建立是FMDV致心肌炎研究中最重要也是最基礎(chǔ)的一個(gè)環(huán)節(jié)，但目前還沒(méi)有很好的用來(lái)研究FMDV心肌炎的動(dòng)物模型。本文建立了FMDV感染乳鼠心肌炎動(dòng)物模型，為FMDV致心肌炎分子機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1乳鼠及病毒接種 3日齡SPF BALB/c乳鼠12只，隨機(jī)分成兩組，6只/組，乳鼠和母鼠一同飼養(yǎng)。A型FMDV病毒來(lái)源于國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞適應(yīng)毒，其毒價(jià)TCID50為106.5，實(shí)驗(yàn)組6只乳鼠全部頸部皮下注射含有105.5TCID50A型FMDV的PBS 100 μL，對(duì)照組6只乳鼠全部頸部皮下接種PBS 100 μL。連續(xù)觀察36 h，取頻臨死亡的實(shí)驗(yàn)組乳鼠和同一時(shí)間的對(duì)照組乳鼠心臟，剪開用滅菌PBS沖洗干凈后，同一乳鼠心臟一分為二分別浸泡于甲醛和戊二醛溶液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2乳鼠心臟H.E染色觀察 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組乳鼠心臟經(jīng)甲醛固定后切割成薄片, 經(jīng)常規(guī)蘇木精-伊紅(H.E)染色封片后顯微鏡下觀察變化。

1.3乳鼠心肌透射電鏡顯微觀察 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組乳鼠心臟浸泡于用PBS配置成的3%的戊二醛溶液中，經(jīng)過(guò)4 ℃固定、預(yù)處理、包埋和切片后放置于JEM-400cx透射電鏡下觀察顯微結(jié)構(gòu)變化。

1.4乳鼠心肌內(nèi)FMDV特異性基因擴(kuò)增 參考GenBank公布的FMDV基因序列(JF792355.1)，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增FMDV VP1基因，上游引物5′- GGC AAG GAC TTT GAG TT，下游引物5′- GCG GTC TTG TGT GGT GTC - 3′ 。分別取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組乳鼠心肌1～3 g，加入適量PBS研磨成10%的懸液, 5 000 r/min離心10 min后取上清，RNA快速提取試劑盒提取總RNA，RT-PCR反應(yīng)體系為：RNase Free ddH2O 15 μL，10×RT buffer 5 μL，MgCl210 μL，dNTPs(10 mmol/L) 5 μL，RNase Inhibitor 1 μL，AMV Reverse Transcriptase 1 μL，AMV-Optimized Taq(5U/μL) 1 μL，上游引物1 μL，下游引物 1 μL，Template RNA 10 μL。反應(yīng)條件為：50 ℃ 35 min；99 ℃ 5 min；進(jìn)入PCR程序?yàn)?4 ℃變性30 s 56.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min共計(jì)35個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束取RT-PCR反應(yīng)液5～10 μL，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后進(jìn)行序列測(cè)定分析。

2 結(jié) 果

2.1接種FMDV后乳鼠觀察 FMDV攻毒后36 h,接種PBS對(duì)照組的乳鼠皮膚紅潤(rùn)，反應(yīng)靈敏，精神狀態(tài)良好(圖1A)，而感染組乳鼠皮膚暗淡無(wú)光，反應(yīng)遲鈍，四肢僵硬，頻臨死亡(圖1B)。

圖1FMDV接種后乳鼠觀察

Fig.1ObservationofsucklingmiceafterFMDVinfection

A: Mouse in negative control group; B: Mouse in experimental group.

2.2乳鼠心肌H.E染色觀察 實(shí)驗(yàn)組乳鼠接種FMDV后36 h H.E染色可見心肌纖維水腫且纖維結(jié)構(gòu)不完整，間質(zhì)充血，中性粒細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2A)，而對(duì)照組乳鼠心肌纖維完整，間質(zhì)、血管等結(jié)構(gòu)均正常清晰(圖2B)。

2.3乳鼠心肌電鏡觀察 經(jīng)透射電鏡觀察可見對(duì)照組乳鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，肌纖維排列整齊，肌節(jié)結(jié)構(gòu)正常(圖3A)，感染組接種FMDV后36 h可見大量心肌細(xì)胞線粒體腫脹，心肌纖維溶解，肌纖維結(jié)構(gòu)不完整(圖3B)。

2.4目的基因擴(kuò)增 感染組6只乳鼠，每只乳鼠心肌中均可擴(kuò)增出FMDV 特異性目的基因VP1(圖4 Lane 1-6)，而對(duì)照組未擴(kuò)增出FMDV特異性目的基因(圖4 Lane 7)。擴(kuò)增出的目的基因經(jīng)序列測(cè)定分析，為FMDV特有的VP1基因序列。

圖2FMDV感染后乳鼠心肌病理切片H.E染色(400×)

Fig.2PathologicsliceofsucklingmicecardiacmusclebyH&Estain(400×)

A: Myocardium of mice in experimental group;

B: Myocardium of mice in negative control group.

圖3FMDV感染后乳鼠心肌透射電鏡觀察(6000×)

Fig.3ObservationofsucklingmicecardiacmuscleunderTEM(6000×)

A:Myocardium of mice in negative control group; B: Myocardium of mice in experimental group.

圖4乳鼠心肌中FMDVVP1基因擴(kuò)增

Fig.4Geneamplificationfromsucklingmicecardiacmuscle

1-6: FMDV detection from myocardium of mice in experimental group; 7: FMDV detection from myocardium of mice in control group; M: DNA ladder 2000.

3 討 論

病毒性心肌炎是由病毒感染引起的心肌間質(zhì)和(或)實(shí)質(zhì)的彌漫性或局限性病變，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞損傷，心肌細(xì)胞變性[10]和心肌纖維之間和血管周圍結(jié)締組織中大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。人們對(duì)口蹄疫的關(guān)注往往局限于唇部水泡或者蹄冠部水泡或者坡行[11]，很少關(guān)注該病毒引起的心肌炎。實(shí)際生產(chǎn)中常見FMDV感染致哺乳幼齡動(dòng)物死亡或者出現(xiàn)青壯年動(dòng)物死亡的病例，這主要是FMDV感染引起急性心肌炎的結(jié)果。目前已知的心肌炎發(fā)病機(jī)制有基因表達(dá)調(diào)控，免疫反應(yīng)[12]，病毒直接作用，心肌纖維化，心肌能量代謝障礙和細(xì)胞凋亡等。感染初期可見病毒引起的心肌細(xì)胞溶解，伴有體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞破壞未感染的心肌細(xì)胞，造成嚴(yán)重的心肌損害[13]，病毒特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞引起被感染的心肌纖維溶解。

本文以3日齡乳鼠為研究對(duì)象，接種FMDV后觀察其死亡和心肌炎表現(xiàn)，經(jīng)H.E染色和透射電鏡觀察，看到明顯的FMDV感染組乳鼠心肌出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和心肌纖維溶解，感染組乳鼠心肌內(nèi)檢測(cè)到FMDV的存在，進(jìn)一步證實(shí)了該變化是由FMDV感染引起的。為安全起見，本試驗(yàn)所有操作均在國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室P3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。該動(dòng)物模型的建立為進(jìn)一步研究FMDV致動(dòng)物心肌炎的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ),下一步的工作將是尋找FMDV感染后炎性心肌細(xì)胞和正常心肌細(xì)胞之間的蛋白質(zhì)組學(xué)差異，鑒定、分析并驗(yàn)證這些差異蛋白在乳鼠心肌炎發(fā)病過(guò)程中所扮演的角色。

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