杜燕華，黃學(xué)勇，王海峰，尤愛國，胡小寧，康 鍇，許汴利

2010年，我國首次從河南省信陽市一名病人血清中分離出新布尼亞病毒，并證明該病毒是引起發(fā)熱伴血小板減少綜合征的病原體，但目前傳染源和傳播途徑還不清楚。河南省信陽市一直是發(fā)熱伴血小板減少綜合征的主要發(fā)病地區(qū)，根據(jù)流行特征、臨床癥狀及生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)該新發(fā)傳染病具有蟲媒傳染病流行傳播的特點(diǎn)，并存在動(dòng)物傳染源或/和儲(chǔ)存宿主的可能，因而本研究選取河南省主要發(fā)病地區(qū)信陽市，開展動(dòng)物中新布尼亞血清抗體的調(diào)查，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本采集 選擇商城縣和光山縣曾經(jīng)有病例感染過的地點(diǎn)作為調(diào)查點(diǎn)，結(jié)合當(dāng)?shù)氐乩砭坝^特點(diǎn)以及與人類活動(dòng)接觸密切程度，選擇鼠、牛、羊、豬和狗這5種當(dāng)?shù)貜V泛存在的動(dòng)物作為調(diào)查對(duì)象。鼠采用籠夜法捕獲后，用注射器取心臟血，其余動(dòng)物由獸醫(yī)配合取全血，分離血清后保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2核酸提取及熒光RT-PCR檢測(cè) 取動(dòng)物血清140 μL，采用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Lot 52904)，按試劑盒說明書進(jìn)行，最終收集50 μL RNA提取液。用新布尼亞病毒RNA檢測(cè)試劑盒(河南省疾病預(yù)防控制中心和與北京華大吉比愛生物技術(shù)有限公司聯(lián)合研制)進(jìn)行PCR擴(kuò)增： 50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min；95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火45 s并采集熒光(設(shè)置儀器收集FAM熒光信號(hào))，40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35為陽性；無Ct值為陰性；Ct值在35～40為可疑樣品，需重新檢測(cè)。

1.3血清抗體檢測(cè) 動(dòng)物血清用樣品稀釋液1∶10稀釋后，連同陰性、陽性對(duì)照加入酶標(biāo)板中，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照，用發(fā)熱伴血小板減少綜合征(SFTS)布尼亞病毒抗體檢測(cè)試劑盒(購自無錫鑫連鑫生物醫(yī)藥科技有限公司)，按說明書進(jìn)行操作。結(jié)果需滿足陽性對(duì)照A值≥1.5;陰性對(duì)照A值0.05，若試驗(yàn)數(shù)據(jù)不符合上述試驗(yàn)有效性標(biāo)準(zhǔn)，則需重復(fù)試驗(yàn)。Cutoff值為陰性對(duì)照平均A值×2.1，若陰性對(duì)照平均A值<0.05，按0.05計(jì)算；若陰性對(duì)照平均A值≥0.05，按實(shí)際A值計(jì)算。檢測(cè)結(jié)果≥cutoff值判為陽性，檢測(cè)結(jié)果

1.4資料分析 用SPSS 11．5進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；采用χ2檢驗(yàn)，P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1調(diào)查點(diǎn)標(biāo)本采集情況 2012年7-9月在河南省信陽市商城縣和光山縣2個(gè)調(diào)查點(diǎn)采集動(dòng)物血液標(biāo)本315份，其中鼠血94份(商城縣58份，光山縣36份)、牛血63份(光山縣63份)、羊血59份(商城縣59份)、豬血56份(商城縣28份，光山縣26份)、狗血40份(商城縣10份，光山縣30份)。

2.2核酸檢測(cè)結(jié)果 將采集到的315份動(dòng)物血清標(biāo)本，用新布尼亞病毒RNA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，陽性對(duì)照和陰性對(duì)照均成立，標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果均為陰性。

2.3血清抗體檢測(cè)結(jié)果 將采集到的312份動(dòng)物血清標(biāo)本，用雙抗原夾心ELISA方法檢測(cè)新布尼亞病毒總抗體，陽性141份，總體陽性率為45.19%，分別為鼠1.06%(1/94)、牛100.00%(63/63)、羊76.27%(45/59)、豬3.57%(2/56)、狗75.00%(30/40)(見圖1)。5種動(dòng)物(鼠、牛、羊、豬和狗)的新布尼亞病毒總抗體陽性率比較，χ2=226.829，P<0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖15種動(dòng)物血清新布尼亞病毒抗體檢測(cè)結(jié)果

Fig.1Detectionofnovelbunyavirusantibodyin5kindsofanimals

3 討 論

新布尼亞病毒是新發(fā)傳染病發(fā)熱伴血小板減少綜合征的主要病原體，經(jīng)基因組進(jìn)化親緣關(guān)系分析證實(shí)屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬，該病毒基因組由大(L)、中(M)、小(S) 3個(gè)單股負(fù)鏈RNA片段組成，電鏡觀察病毒形態(tài)呈球形，直徑80～100 nm，形態(tài)學(xué)上和基因組特征都與布尼亞病毒科病毒相似；而布尼亞病毒科除漢坦病毒外，其余感染人的病毒大多是由蟲媒傳播的[1]。根據(jù)發(fā)熱伴血小板減少綜合征的流行特征、病例臨床癥狀、疾病進(jìn)程規(guī)律、新布尼亞病毒生物學(xué)特性以及同科病原如裂谷熱病毒、蛉熱病毒、克里米亞─剛果出血熱病毒等取得研究成果相比較，該新發(fā)傳染病具有蟲媒傳染病流行傳播的特點(diǎn)[2-3]，并且在河南省信陽市發(fā)病地區(qū)的蜱、牛虻中也檢測(cè)并分離到了新布尼亞病毒[4]，在江蘇省的牛、羊等動(dòng)物血清中也有檢測(cè)到新布尼亞病毒抗體的報(bào)道[5]，推斷該新發(fā)傳染可能存在動(dòng)物傳染源或/和儲(chǔ)存宿主，本次調(diào)查也證實(shí)了在我國新布尼亞病毒的主要發(fā)病區(qū)域河南省信陽市動(dòng)物中存在病毒抗體。

我國目前河南、湖北、山東、江蘇、安徽、浙江、遼寧等省已有發(fā)熱伴血小板減少綜合征病例報(bào)道，且越來越多省份和地市也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了類似病例，已經(jīng)受到了各級(jí)政府和衛(wèi)生行政部門及社會(huì)的廣泛關(guān)注，2010年9月8日，國內(nèi)媒體報(bào)道河南省信陽市商城縣“蜱蟲叮咬致人死亡事件”，引起社會(huì)各界廣泛關(guān)注，甚至一度造成了局部恐慌[6-7]。河南省信陽市是我國目前發(fā)熱伴血小板減少綜合征疫情最嚴(yán)重并持續(xù)流行的地區(qū)，根據(jù)2007-2011年河南省發(fā)熱伴血小板減少綜合征的監(jiān)測(cè)結(jié)果，信陽市占全省報(bào)告病例的98%以上，商城縣和光山縣是報(bào)告發(fā)病數(shù)最多的縣區(qū)[8]，因而本次研究選擇商城縣和光山縣病例曾經(jīng)感染過的地點(diǎn)作為調(diào)查點(diǎn)，結(jié)合當(dāng)?shù)氐乩砭坝^特點(diǎn)以及與人類活動(dòng)接觸密切程度，選擇了鼠、牛、羊、豬和狗5種動(dòng)物作為調(diào)查對(duì)象，結(jié)果顯示動(dòng)物血清新布尼亞病毒抗體總陽性率(33.56%)，顯著高于江蘇省(11.06%)[5]，可能與人群發(fā)病率的高低有相關(guān)性。對(duì)于調(diào)查的鼠、牛、羊、豬和狗5種動(dòng)物，新布尼亞病毒總抗體陽性率有顯著差異，牛、羊和狗的抗體陽性率遠(yuǎn)高于鼠和豬。提示牛、羊和狗感染過新布尼亞病毒，牛、羊和狗都是家養(yǎng)動(dòng)物，但并未發(fā)現(xiàn)有明顯的臨床癥狀，可能為隱性感染，在對(duì)信陽市的兩個(gè)調(diào)查點(diǎn)采樣時(shí)發(fā)現(xiàn)，目前牛、羊和狗多散養(yǎng)，且動(dòng)物身上攜帶蜱或有牛虻叮咬史，因而存在成為新布尼亞病毒儲(chǔ)存宿主的可能。雖然動(dòng)物血清標(biāo)本中未檢測(cè)到新布尼亞病毒，但是也不能排除其成為儲(chǔ)存宿主的可能，如乙腦病毒的儲(chǔ)存宿主豬感染病毒后并無腦炎的臨床癥狀，若錯(cuò)過了急性感染期的病毒血癥期再采血，就檢測(cè)不到病毒核酸[9]，而新布尼亞病毒感染動(dòng)物也存在這種可能，但要證實(shí)這種可能尚需要長期開展對(duì)動(dòng)物宿主的監(jiān)測(cè)以及更深入的病毒感染實(shí)驗(yàn)研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Xu BL. Discovery, understanding and inspiration for severe fever with thrombocytopenia syndrome caused by a novel Bunyavirus[J]. Chin J Prev Med, 2012, 46(2): 99-102. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2012.02. 001 (in Chinese)

許汴利. 新布尼亞病毒感染致發(fā)熱伴血小板減少綜合征的發(fā)現(xiàn)、認(rèn)識(shí)與啟示[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 46(2): 99-102.

[2]Xu BL, Liu LC, Huang XY, et al. Metagenomic analysis of fever, thrombocytopenia and leukopenia syndrome (FTLS) in Henan province, China: discovery of a novel bunyavirus[J]. PLoS Pathog, 2011, 7: 1-10. DOI: 10.1371/journal.ppat.1002369

[3]Yu XJ, Liang MF, Zhang SY, et al. Fever with thrombocytopenia associated with a novel bunyavirus in China[J]. N Engl J Med, 2011, 364(16): 1523-1532. DOI: 10.1056/NEJMoa1010095

[4]Liu Y, Huang XY, Du YH, et al. Survey on ticks and detection of new bunyavirus in some vector in the endemic areas of fever．thrombocytopenia and leukopenia syndrome(FTLS)in Henan province[J]. Chin J Prev Med, 2012, 46(6): 500-504. DOI: 10.3760/emm j.issrL 0253-9624.2012. 06．005 (in Chinese)

劉洋，黃學(xué)勇，杜燕華, 等. 河南發(fā)熱伴血小板減少綜合征流行區(qū)蜱類分布及媒介攜帶新布民亞病毒狀況調(diào)查[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2012，46(6)：500-504.

[5]Zhang WS, Zeng XY, Zhou MH, et al. Seroepidemiology of severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus in Jiangsu province[J]. Dis Surveill, 2011, 26(9): 676-678. (in Chinese)

張文帥，曾曉燕，周明浩，等. 江蘇省發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒血清流行病學(xué)調(diào)查[J]. 疾病監(jiān)測(cè)，2011，(26)9：676-679.

[6]Ministry of Health of People’s Republic of China. National guideline for prevention and control of severe fever with thrombocytopenia syndrome[M]. Beijing: Ministry of Health of People’s Republic of China, 2010. (in Chinese)

中華人民共和國衛(wèi)生部. 發(fā)熱伴血小板減少綜合征防治指南[M].2010版. 北京：中華人民共和國衛(wèi)生部，2010.

[7]Tang XY, Cui N, Kang K, et al. Analysis an the diagnosis and treatment of a cluster of cases infected by new bunyavirus[J]. Chin J Prev Med, 2012, 46(2): 110-113. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2012. 02.004 (in Chinese)

唐曉燕, 崔寧, 康鍇，等. 一起聚集性新布尼亞病毒感染病例的診斷與治療分析[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 46(2):110-113.

[8]Kang K, Tang XY, Xu BL, et al. Analysis of epidemic characteristics of fever and thrombocytopenia syndrome in Henan province, 2007-2011[J]. Chin J Prev Med, 2012, 46(2): 106-109. DOI: 10.3760/cma.j.issn. 0253-9624.2012.02.003 (in Chinese)

康鍇, 唐曉燕, 許汴利, 等. 河南省2007-2011年發(fā)熱伴血小板減少綜合征流行特征分析[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 46(2): 106-109.

[9]Zhang HL, Liang GD. Arboviruses and arboviral diseases in China[J]. Chin J Vect Biol Ctrl, 2012, 23(5): 377-380. (in Chinese)

張海林，梁國棟.中國蟲媒病毒和蟲媒病毒病[J].中國媒介生物學(xué)及控制雜志，2012,23(5):377-380.