余 源，陳 陽，葛 爽，王 洋，李巍偉，趙麗娜，劉阿倩，林志強(qiáng)，高 雪，田喜鳳

藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(Giardialamblia，簡(jiǎn)稱賈第蟲) 寄生于人和多種哺乳動(dòng)物的小腸內(nèi)，引起以腹瀉為主要癥狀的藍(lán)氏賈第鞭毛蟲病(giardiasis, 簡(jiǎn)稱賈第蟲病)[1]。賈第蟲地理分布廣泛，有多種動(dòng)物宿主，因此可通過糞便、被污染的水源、食物進(jìn)行傳播。本病已被列為全世界危害人類健康的10種主要寄生蟲病之一。在發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家均有廣泛流行[2-3]。以往國(guó)內(nèi)對(duì)其危害性未能引起足夠的重視，實(shí)驗(yàn)研究起步較晚，在70年代以前一直處于空白狀態(tài)，至80年代始開展了具有實(shí)質(zhì)性的研究。隨著國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)其認(rèn)識(shí)的不斷深入，研究也不斷豐富了起來[4-5]。賈第蟲雙核、具有鞭毛，其腹部的吸盤是吸附小腸的主要結(jié)構(gòu)，主要成分是細(xì)胞骨架蛋白。Crossley和Holberton[6-7]首次提出賈第素是賈第蟲細(xì)胞骨架的特有成分。賈第素分為4大類, 即α、β、γ和δ賈第素[8-10]。pathuri等[11]發(fā)現(xiàn)所有α-賈第素都可能是進(jìn)化過程中膜聯(lián)蛋白的代表，并且很可能具有保守的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，而行使相似的功能。研究表明，細(xì)胞骨架蛋白與賈第蟲吸附宿主腸上皮并導(dǎo)致腹瀉密切相關(guān)。因此，對(duì)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲α-賈第素的研究有一定的臨床應(yīng)用前景。本研究采用含有雙氫青蒿素的改良TYI-S-33培養(yǎng)基培養(yǎng)C2株藍(lán)氏賈第鞭毛蟲，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)雙氫青蒿素對(duì)C2株藍(lán)氏賈第鞭毛蟲Alpha -7.3 giardin基因mRNA表達(dá)水平的影響，為藍(lán)氏賈第鞭毛蟲的防治提供了有價(jià)值的參考資料。

1 材料與方法

1.1材料 雙氫青蒿素粉劑(原藥批號(hào)010904)為北京豐臺(tái)科技園生物技術(shù)公司藤海寧女士惠贈(zèng)；C2株賈第蟲由本實(shí)驗(yàn)室保存；組織/細(xì)胞基因組RNA提取試劑盒購(gòu)自Invitrogen；引物由生工生物工程(上海)公司合成；dNTP, SYBR? Premix Ex TaqTMReal-Time PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；M-LMV 逆轉(zhuǎn)錄酶，RNase inhibitor，Random Primers購(gòu)自Promega公司；焦碳酸二乙酯(DEPC)購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1蟲體的復(fù)蘇培養(yǎng) 藍(lán)氏賈第鞭毛蟲C2株, 由首都醫(yī)科大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室提供，本室用液氮冷凍保種，將液氮內(nèi)凍存的C2株賈第蟲復(fù)蘇，置含改良TYI-S-33培養(yǎng)基的4 mL硼酸硅培養(yǎng)管內(nèi)，于37 ℃培養(yǎng)。48～72 h后，蟲體即呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。選取蟲體生長(zhǎng)旺盛的培養(yǎng)管，置4 ℃冰浴，15 min后取出，在雙手掌間多次滾搓培養(yǎng)管，使貼壁生長(zhǎng)的蟲體完全自管壁脫落。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)蟲數(shù)，再用培養(yǎng)基將蟲液濃度調(diào)為6×106～10×106個(gè)滋養(yǎng)體/mL[12]，傳代培養(yǎng)。

1.2.2藥物試驗(yàn)及蟲體總RNA提取 待蟲體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，選取蟲體貼滿瓶壁的培養(yǎng)管，培養(yǎng)基內(nèi)分別加入100 μg/mL 、200 μg/mL雙氫青蒿素[13]；對(duì)照組培養(yǎng)基內(nèi)不加藥，37 ℃分別培養(yǎng)2 h、4 h、8 h、12 h后，收集蟲體，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)蟲數(shù)，用培養(yǎng)基將蟲液濃度調(diào)至1×107個(gè)滋養(yǎng)體/mL； 取1 mL 蟲液，用PBS(pH7.4)清洗3次，4 000 r/min離心10 min，棄上清，留沉淀。

加入1 mL Trizol(Invitrogen)裂解蟲體，迅速吸入無RNase的1.5 mL eppendorf離心管中，按照Invitrogen Trizol RNA提取說明書提取總RNA，通過紫外分光光度法鑒定總RNA的純度，1%瓊脂糖凝膠中電泳鑒定提取質(zhì)量。

1.2.3cDNA的合成 以各組提取的總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。建立20 μL反轉(zhuǎn)錄體系：總RNA 8 μL，Random Primers(100 ng/μL) 1 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，RNase inhibitor 1 μL，M-MLV 1 μL，5×反應(yīng)緩沖液4 μL，DEPC處理水補(bǔ)至20 μL；反轉(zhuǎn)錄條件：70 ℃變性5 min，42 ℃反轉(zhuǎn)錄60 min，即得cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4引物設(shè)計(jì) 分別設(shè)計(jì)Alpha -7.3 giardin及GAPDH(內(nèi)參基因)引物，引物設(shè)計(jì)參考GenBank報(bào)道的藍(lán)氏賈第鞭毛蟲Alpha -7.3 giardin (XM_001708403.1)和GAPDH (XM_001704991.1)基因序列，采用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物由生工生物工程(上海)公司合成(表1)。

表1 Alpha -7.3 giardin和GAPDH引物序列

1.2.5Real-Time PCR 采用Corbett實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，以賈第蟲磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)為內(nèi)參基因，cDNA為模板，分別以Alpha-7.3 giardinS/Alpha-7.3 giardinA; GAPDHS/GAPDHA為引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品均做2個(gè)重復(fù)反應(yīng)。反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，2×SYBR MIX 10 μL，Prime S 1 μL，Prime A 1 μL，DEPC H2O 7 μL，反應(yīng)條件：95 ℃變性15 s，60 ℃復(fù)性15 s，72 ℃延伸15 s，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行Delta Delta CT分析。

2 結(jié) 果

2.1總RNA提取結(jié)果 利用Invitrogen TRIzol提取雙氫青蒿素培養(yǎng)的不同組藍(lán)氏賈第鞭毛蟲總RNA，各組OD260/OD280值均在1.8～2.0范圍內(nèi)，總RNA提取質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.2Real-Time PCR檢測(cè)結(jié)果 采用雙氫青蒿素濃度為100 μg/mL、200 μg/mL的改良TYI-S-33培養(yǎng)基分別培養(yǎng)C2株藍(lán)氏賈第鞭毛蟲2 h、4 h、8 h、12 h后，以不含藥物組為對(duì)照，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)雙氫青蒿素對(duì)C2株藍(lán)氏賈第鞭毛蟲Alpha-7.3 giardin基因mRNA的表達(dá)量(圖1-4)，Delta Delta CT法分析Alpha-7.3 giardin基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量(表2)，雙氫青蒿素濃度為100 μg/mL，分別培養(yǎng)2 h、4 h、8 h、12 h后，Alpha-7.3 giardin基因mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.95，0.91，0.60，0.03；雙氫青蒿素濃度為200 μg/mL，分別培養(yǎng)2 h、4 h、8 h、12 h后，Alpha-7.3 giardin基因mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.56，0.46，0.23，0.06；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雙氫青蒿素對(duì)C2株藍(lán)氏賈第鞭毛蟲Alpha-7.3 giardin基因mRNA的表達(dá)具有明顯的抑制作用，抑制效果與藥物濃度和作用時(shí)間相關(guān)，提示雙氫青蒿素對(duì)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲骨架蛋白具有損傷作用。

圖1 Alpha-7.3 giardin mRNA 實(shí)時(shí)RT-PCR擴(kuò)增曲線

圖2 Alpha-7.3 giardin mRNA 實(shí)時(shí)RT-PCR熔解曲線

圖3 GAPDH mRNA 實(shí)時(shí)RT-PCR擴(kuò)增曲線

圖4 GAPDH mRNA 實(shí)時(shí)RT-PCR熔解曲線

3 討 論

定量PCR是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)( real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR) 于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出，它是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程[14-15]，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA模板的定量, 而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強(qiáng)、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無污染性、具實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn), 目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)記錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，克服了終點(diǎn)法定量PCR產(chǎn)物的不足，使準(zhǔn)確定量RNA成為現(xiàn)實(shí)[16-17]。熒光實(shí)時(shí)RT-PCR 定量基因表達(dá)常采用兩類方法，即絕對(duì)定量和相對(duì)定量。絕對(duì)定量法需要構(gòu)建載體，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；相對(duì)定量通常以表達(dá)恒定的看家基因作為參照，來獲得目的基因相對(duì)于參照基因的表達(dá)指數(shù)。實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組目的基因表達(dá)指數(shù)的比值就代表目的基因的相對(duì)表達(dá)量，反映實(shí)驗(yàn)組基因表達(dá)的變化情況[18]。

本研究采用含有不同濃度雙氫青蒿素的改良TYI-S-33培養(yǎng)基分別以不同時(shí)間培養(yǎng)C2株藍(lán)氏賈第鞭毛蟲，以賈第蟲磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)作為內(nèi)參基因，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)雙氫青蒿素對(duì)C2株藍(lán)氏賈第鞭毛蟲Alpha -7.3 giardin基因mRNA表達(dá)水平的影響。研究結(jié)果表明，經(jīng)含有雙氫青蒿素的培養(yǎng)基培養(yǎng)賈第蟲后，藍(lán)氏賈第鞭毛蟲Alpha -7.3 giardin基因mRNA的表達(dá)具有明顯的抑制作用，抑制效果與藥物濃度和作用時(shí)間相關(guān)，揭示了雙氫青蒿素對(duì)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲骨架蛋白具有損傷作用，這一結(jié)果與藍(lán)氏賈第鞭毛蟲骨架蛋白雙向電泳質(zhì)譜結(jié)果相吻合[19]。由于藍(lán)氏賈第鞭毛蟲腹部的吸盤是吸附小腸的主要結(jié)構(gòu)，其主要成分是細(xì)胞骨架蛋白，因此雙氫青蒿素對(duì)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲具有明顯的防治效果，本研究為以藍(lán)氏賈第鞭毛蟲細(xì)胞骨架成分作為新藥物開發(fā)的靶分子的進(jìn)一步研究提供了有價(jià)值的參考資料。

表2 DHA作用后Alpha -7.3 giardin基因mRNA表達(dá)量分析結(jié)果

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