李園園，程 松，陸俊梅，胡忠義，崔振玲

胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacteriumintracellulare)是鳥-胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumavium-intracellularecomplex，MAC)中一類重要的病原菌亞種，可以導(dǎo)致人肺部、淋巴結(jié)、皮膚等多器官的感染，也可導(dǎo)致動物的感染和傳播[1-3]，是一類重要的人獸共患病傳染源。胞內(nèi)分枝桿菌與MAC內(nèi)其他亞種感染的宿主存在差異[2-3]，對治療藥物的藥物敏感性也存在差異[4]，因此對胞內(nèi)分枝桿菌進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定對于MAC病的流行病學(xué)研究和臨床治療具有重要意義。本研究建立了RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測聯(lián)合熔解曲線分析技術(shù)(RNA isothermal transcription-mediated amplification and real-time detection combined melt curve analysis，RIARD-MCA)快速鑒定胞內(nèi)分枝桿菌的方法，并初步評價(jià)其對臨床分離株的鑒定效果。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.121種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株，來自國家菌種保存中心，分別為：結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(M.tuberculosis，ATCC27294)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansassi，ATCC12478)、胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare，ATCC13950)、龜分枝桿菌(M.chelonae，ATCC14472)、草分枝桿菌(M.phlei，ATCC11758)、偶發(fā)分枝桿菌(M.fortuitum，ATCC6481)、戈登分枝桿菌(M.gordonae，ATCC14470)、金色分枝桿菌(M.aurum，ATCC23366)、淡黃分枝桿菌(M.gilvum，ATCC43909)、副偶發(fā)分枝桿菌(M.parafortuitum，ATCC19686)、恥垢分枝桿菌(M.smegmatis， ATCC19420)、海分枝桿菌(M.marinum，ATCC927)、愛知分枝桿菌(M.aichiense，ATCC27280)、新金色分枝桿菌(M.neoaurum， ATCC25795)、土分枝桿菌(M.terra，ATCC19619)、不產(chǎn)色分枝桿菌(M.nonchromogenicum，ATCC19530)、母牛分枝桿菌(M.vaccae，ATCC15483)、田鼠分枝桿菌(M.microti，ATCC19422)、鳥分枝桿菌(M.avium，ATCC25291)、瘰疬分枝桿菌(M.scrofulaceum，ATCC19981)、瑪爾摩分枝桿菌(M.malmoense，ATCC29571)。

1.1.25種呼吸道常見非分枝桿菌致病菌，由上海市肺科醫(yī)院檢驗(yàn)科普通微生物實(shí)驗(yàn)室分離并經(jīng)過16S rRNA測序鑒定[5]，分別為：肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、溶血性鏈球菌(Hemolyticstreptococcus)、綠膿假單胞菌(Pseudomonaspyocyaneum)、鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)。

1.1.3180株NTM臨床分離株和49株MTB臨床分離株，來自上海市肺科醫(yī)院結(jié)核病(肺)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌株庫。

1.2方法

1.2.1RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌方法 以胞內(nèi)分枝桿菌的16S rRNA的特異序列為檢測靶標(biāo)設(shè)計(jì)RNA探針和帶有T7啟動子的逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增引物，建立胞內(nèi)分枝桿菌RNA恒溫?cái)U(kuò)增體系。將待檢菌株13 000 r/min離心5 min，棄上清，加入50 μL樣本稀釋液(10 mmol/L檸檬酸鈉，pH8.0，DEPC處理過的無菌H2O配制)重懸后放入超聲清洗器中進(jìn)行超聲處理15 min，超聲功率300 W。陽性對照、陰性對照與待檢菌株同步進(jìn)行，陽性對照為活的胞內(nèi)分枝桿菌，陰性對照為無菌水。超聲結(jié)束后，取2 μL處理物加入預(yù)先混合好的30 μL擴(kuò)增檢測液(40 mmol/L Tris-HCl緩沖液 pH 8.1, 8 mmol/L 氯化鎂, 25 mmol/L 氯化鈉, 2 mmol/L 亞精胺, 5 mmol/L 二硫蘇糖醇, 80 μg/mL 牛血清白蛋白，dATP、dTTP、dGTP和 dCTP各200 μmmol/L, ATP、GTP、CTP和 UTP各1 mmol/L，引物濃度和探針濃度均為0.5 mmol/L)中。將反應(yīng)管置于干熱恒溫器上60 ℃保溫10 min后，再置于42 ℃保溫5 min，同時(shí)將酶液預(yù)熱至42 ℃。預(yù)熱后，向每支反應(yīng)管中加入10 μL酶液(含M-MLV和T7 RNA轉(zhuǎn)錄酶各2000 U)，混勻后將反應(yīng)管快速轉(zhuǎn)至實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI 7500，購自美國Applied Biosystems公司)中啟動反應(yīng)程序。反應(yīng)程序?yàn)椋簾晒馔ǖ涝O(shè)定為FAM，每個(gè)循環(huán)為42 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)；熒光信號收集每分鐘進(jìn)行1次，共檢測40次。樣本曲線與閾值線交叉點(diǎn)的橫坐標(biāo)讀數(shù)為dt值，dt<40的樣本為擴(kuò)增陽性樣本。RNA恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)束后立即進(jìn)行40 ℃～95℃熔解曲線分析。RNA恒溫?cái)U(kuò)增曲線陽性且熔解曲線與胞內(nèi)分枝桿菌陽性對照一致的判定為胞內(nèi)分枝桿菌；僅擴(kuò)增曲線陽性，但熔解曲線與胞內(nèi)分枝桿菌不一致，或者擴(kuò)增曲線陰性則判定為非胞內(nèi)分枝桿菌。引物序列5′-TTCTAAGCCTGGGAAA-3′和5′-AATTTAATACGACTCACGGGATATAGGGAGACCACCAACAAGCTGATAGGC-3′，探針序列為5′-CGUGGACCUUUAGGCGCACCACG-3′，5′端FAM標(biāo)記，3′端DABCYL標(biāo)記。檢測全程操作及檢測時(shí)間約2 h。引物由上海生物工程公司合成，RNA探針由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，其他檢測試劑購自上海仁度生物科技有限公司。

1.2.2RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌特異度 將21種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株在米氏7H10培養(yǎng)基(購自美國Becton，Dickinson)上的陽性培養(yǎng)物和5種呼吸道常見致病非分枝桿菌在血平板培養(yǎng)基(溶血性鏈球菌)和麥康凱培養(yǎng)基(銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、綠膿假單胞菌)上的陽性培養(yǎng)物，用生理鹽水磨菌比濁至1 mg/mL，各取1 mL菌懸液進(jìn)行RIARD-MCA檢測。

1.2.3RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌靈敏度 將胞內(nèi)分枝桿菌在米氏7H10上培養(yǎng)的陽性培養(yǎng)物，用生理鹽水磨菌比濁至1 mg/mL(相當(dāng)于1×107條細(xì)菌/mL)，再用生理鹽水作1×10-1～1×10-9稀釋。從每個(gè)稀釋度取1 mL菌懸液進(jìn)行RIARD-MCA檢測，同時(shí)每個(gè)稀釋度取100 μL菌懸液接種于米氏7H10培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2～3周后進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)。

1.2.4RIARD-MCA鑒定分枝桿菌臨床分離株 將229株分枝桿菌臨床分離株的陽性培養(yǎng)物，每份陽性培養(yǎng)物等分為3份，一份用于RIARD-MCA檢測，一份用于測序檢測，一份凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5PCR基因測序菌種鑒定 用測序法對所有菌株的16S rRNA及hsp65基因進(jìn)行擴(kuò)增測序，16S rRNA基因PCR擴(kuò)增引物序列為：F1：5’- TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3’，R1：5’- TACCGCGGCTGCTGGCAC-3’，片段大小為500 bp[5]。hsp65基因擴(kuò)增引物為：F2:5’-ATCGCCAAGGAGATCGAGCT-3’，R2:5’-AAGGTGCCGCGGATCTTGTT-3’，片段大小為644 bp[6]。PCR擴(kuò)增試劑使用PrimeSTAR?HS DNA 聚合酶及配套緩沖液(購自大連寶生物公司)，測序送華大基因測序部完成。測序結(jié)果通過http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)站的核酸blast在線比對軟件進(jìn)行同源性分析，以鑒定菌種。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以PCR基因測序菌種鑒定結(jié)果為參考方法，評價(jià)RIARD-MCA法鑒定胞內(nèi)分枝桿菌的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和kappa檢驗(yàn)值。

2 結(jié) 果

2.1RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌特異度 21種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和5種呼吸道常見致病非分枝桿菌檢測結(jié)果顯示：RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)檢測時(shí)胞內(nèi)、鳥分枝桿菌均為陽性(圖1a)，熔解曲線可有效區(qū)分胞內(nèi)與鳥分枝桿菌(圖1b)，RNA恒溫?cái)U(kuò)增陽性且熔解曲線起峰位置與胞內(nèi)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株一致為胞內(nèi)分枝桿菌。

2.2RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌靈敏度 RIARD-MCA可以檢測至10-5mg/mL檢測管，根據(jù)米氏7H10培養(yǎng)基菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，10-5mg/mL檢測管對應(yīng)100 CFU/mL濃度，RIARD-MCA靈敏度可達(dá)100 CFU/mL(圖2)。

圖1RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌檢測圖中英文對照

Fig.1SpecificityofRIARD-MCAonidentificationanddetectionforM.intracellulare

a: Amplification curve of RIARD-MAC; b: Melting curve of RIARD-MCA;

1, 5:M.intracellulare; 2, 4:M.avium; 3, 6: Othermycobacterium, 5 common bacteria of respiratory tract and negative control.

圖2RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌靈敏度檢測圖

Fig.2SensitivityofRIARD-MCAonidentificationanddetectionforM.intracellulare

1: 107CFU/mL; 2: 106CFU/mL; 3: 105CFU/mL; 4: 104CFU/mL; 5: 103CFU/mL; 6: 102CFU/mL; 7: 101CFU/mL, 100CFU/mL, 10-1, 10-2, 10-3CFU/mL and negative control.

2.3RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌臨床分離株結(jié)果 229株分枝桿菌臨床分離株中，RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌63株；PCR測序63株全為胞內(nèi)分枝桿菌。

166株RIARD-MCA判定為非胞內(nèi)分枝桿菌，PCR測序全為非胞內(nèi)分枝桿菌。其中鳥分枝桿菌7株，偶發(fā)分枝桿菌5株，堪薩斯分枝桿菌3株，膿腫分枝桿菌36株，龜分枝桿菌1株，M.massiliense21株，M.bolletii2株，海分枝桿菌5株，戈登分枝桿菌7株，金色分枝桿菌13株，瘰疬分枝桿菌1株，副瘰疬分枝桿菌2株，MTB 49株，M.colombiense2株，M.marseillense3株，其余9株blast沒找到完全匹配的菌種，分別接近慢性黃分枝桿菌(M.lentiflavum)，戈登分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、土分枝桿菌、M.algericum、M.engbekii、M.kumamotonense、M.peregrinum、M.interjectum。以PCR測序結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，RIARD-MCA法鑒定胞內(nèi)分枝桿菌的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為100%、100%，100%、100%，kappa值為1(表1)。

表1229株分枝桿菌RIARD-MCA鑒定結(jié)果

Tab.1RIARD-MCAidentificationanddetectionof229mycobacteria

RIARD-MCA基因測序Gene sequencing胞內(nèi)分枝桿菌M. intracellular其他分枝桿菌Other mycobacteria胞內(nèi)分枝桿菌M. intracellular630其他分枝桿菌Other mycobacteria0166

3 討 論

近年來，非結(jié)核分枝桿菌(Nontuberculousmycobacteria，NTM)病在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢，已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題[7]。胞內(nèi)分枝桿菌時(shí)一種可導(dǎo)致人類感染發(fā)病的病原體，其感染率在MAC感染中可達(dá)45%～81%[7-9]。胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌是MAC中兩個(gè)重要的亞種，均可侵犯人和動物的肺臟、淋巴結(jié)、骨骼、皮膚、胃腸道及泌尿生殖道等并造成全身散播[1-4]，但其致病宿主、發(fā)病過程及治療均存在一定差異。MAC亞種的準(zhǔn)確區(qū)分鑒定，對于明確傳染源，了解病原體的傳播，制定更加準(zhǔn)確有針對性的治療方案具有重要的意義，因此，有效區(qū)分鳥、胞內(nèi)分枝桿菌至關(guān)重要。胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌均屬于緩慢生長分枝桿菌，培養(yǎng)周期長，通過傳統(tǒng)的生化方法很難區(qū)分，在無菌種鑒定的情況下易被誤診為結(jié)核分枝桿菌感染[10]。近年來，隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)發(fā)展和對菌種基因序列研究的深入，國內(nèi)外學(xué)者均通過引入新的分子鑒定方法使分枝桿菌菌種鑒定從表型和生化水平轉(zhuǎn)入基因水平，并開始應(yīng)用于分枝桿菌感染的分子診斷[4，11-13]。

Richardson等[11]以16S rRNA為檢測靶標(biāo)采用多重?zé)晒舛縋CR技術(shù)，檢測MAC的靈敏度為99%，但尚無法區(qū)分鳥、胞內(nèi)分枝桿菌。Park等[12]以ITS為檢測靶標(biāo)采用DNA探針雜交只能鑒定到MAC，也無法區(qū)分鳥、胞分枝桿菌。Kim等[13]以hsp65為鑒定靶標(biāo)采用多探針熒光定量PCR聯(lián)合熔解曲線分析可以準(zhǔn)確鑒定胞內(nèi)分枝桿菌。上述基于DNA靶標(biāo)的檢測，多數(shù)菌種鑒定僅限于MAC水平，且以DNA為靶標(biāo)的檢測無法區(qū)分死菌活菌，還易受到DNA氣溶膠的污染，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。法國生物梅里埃公司的Accuprobe胞內(nèi)分枝桿菌檢測試劑盒[4]，以胞內(nèi)分枝桿菌核糖體RNA為檢測靶標(biāo)，通過RNA探針與臨床分離株菌體釋放出的RNA直接雜交檢測胞內(nèi)分枝桿菌，從而實(shí)現(xiàn)較高的特異度，但該試劑盒需要較大的菌量。

本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)成功建立基于RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)熒光檢測技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌的方法[14]，根據(jù)研究報(bào)道16S rRNA序列可以區(qū)分鑒定鳥分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌[15]，本研究以胞內(nèi)分枝桿菌的16S rRNA的特異序列為檢測靶標(biāo)，利用帶有T7啟動子的引物，在恒溫條件下大量擴(kuò)增靶標(biāo)RNA，通過胞內(nèi)分枝桿菌特異的RNA探針與靶標(biāo)RNA的特異雜交，釋放出熒光信號，從而實(shí)現(xiàn)對胞內(nèi)分枝桿菌的檢測。與其他以16S rDNA為靶標(biāo)的研究相似，由于胞內(nèi)分枝桿菌與鳥胞復(fù)合群內(nèi)其他亞種的16S rRNA靶標(biāo)序列僅有1～3個(gè)堿基的差異，僅通過RNA探針雜交難以準(zhǔn)確區(qū)分胞內(nèi)分枝桿菌與其他鳥胞內(nèi)分枝桿菌亞種[11]，本研究為了進(jìn)一步提高胞內(nèi)分枝桿菌檢測的特異度，將RNA恒溫?cái)U(kuò)增檢測與熔解曲線分析聯(lián)合使用，可大幅提高檢測胞內(nèi)分枝桿菌的特異度。

本研究以16s rDNA和hsp65基因測序?yàn)榉肿泳N鑒定為參考方法[5-6]，對RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行初步評價(jià)。結(jié)果顯示RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌具有較高的特異度，與結(jié)核分枝桿菌、18種非結(jié)核分枝桿菌及呼吸道常見的非分枝桿菌無交叉反應(yīng)，且能在229株23種分枝桿菌臨床分離株中準(zhǔn)確的鑒定胞內(nèi)分枝桿菌，其特異度可達(dá)100%，與Kim等[13]以hsp65 DNA為靶標(biāo)的檢測研究結(jié)果相同。RIARD-MCA擴(kuò)增產(chǎn)物為RNA，極易降解，相比較DNA擴(kuò)增可減少實(shí)驗(yàn)室的交叉污染，且16S rRNA在活菌內(nèi)的拷貝數(shù)高于hsp65 DNA的拷貝數(shù)，可以提高檢測的靈敏度。RIARD-MCA法檢測胞內(nèi)分枝桿菌與Accuprobe胞內(nèi)分枝桿菌檢測試劑盒的特異度相似，檢測臨床分離株的靈敏度也均為100%[4]，但是RIARD-MCA檢測胞內(nèi)分枝桿菌臨床分枝株方法學(xué)靈敏度為100 CFU/mL，其方法學(xué)檢測靈敏度高于Accuprobe胞內(nèi)分枝桿菌檢測試劑盒，具有直接檢測臨床標(biāo)本中胞內(nèi)分枝桿菌的潛力。

本研究建立的RIARD-MCA鑒定胞內(nèi)分枝桿菌方法，RNA提取僅需要15 min超聲裂解，不需要復(fù)雜的提取過程，操作簡單，用一般實(shí)驗(yàn)室常規(guī)配備的實(shí)時(shí)定量PCR儀即可進(jìn)行檢測，檢測時(shí)間僅約2 h，具有簡便、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)勢，可以作為一種新型胞內(nèi)分枝桿菌分子鑒定方法用于臨床分離株的鑒定。

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