劉穎，劉茂柯，任道群，姚萬春，田新惠，張星宇，唐玉明*

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所生物中心，四川瀘州646000；2.四川省瀘州市釀酒科學(xué)研究所，四川瀘州646000）

利用DGGE分析窖泥復(fù)合功能菌液的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

劉穎1，2，劉茂柯1，2，任道群1，2，姚萬春1，2，田新惠1，2，張星宇1，2，唐玉明1，2*

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所生物中心，四川瀘州646000；2.四川省瀘州市釀酒科學(xué)研究所，四川瀘州646000）

采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析窖泥復(fù)合功能菌液中各原料(窖泥、酒糟、大曲粉、黃水、己酸菌)對其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。群落結(jié)構(gòu)相似性分析結(jié)果顯示，從窖泥復(fù)合功能菌液原配方中去除酒糟、己酸菌和黃水后進(jìn)行培養(yǎng)，菌液細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與窖泥復(fù)合功能菌液的相似性指數(shù)(Sc)僅為0.34；多樣性指數(shù)分析結(jié)果顯示，去除酒糟或己酸菌，細(xì)菌多樣性指數(shù)(H)顯著下降(p＜0.05)，去除己酸菌的窖泥復(fù)合功能菌液多樣性指數(shù)(H)下降最為明顯。結(jié)果表明，窖泥復(fù)合功能菌液中各組分對菌液的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在一定影響，其中以己酸菌的影響最大。該研究為改良優(yōu)化窖泥復(fù)合功能菌液的配方提供理論依據(jù)。

窖泥復(fù)合功能菌液；細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；變性梯度凝膠電泳

濃香型白酒的生產(chǎn)是窖泥、糟醅、曲藥微生物之間協(xié)同發(fā)酵的結(jié)果。窖泥作為濃香型白酒釀造的基礎(chǔ)，在長期的釀酒發(fā)酵過程中，富集了大量的與產(chǎn)香有關(guān)的功能微生物，其質(zhì)量的優(yōu)劣在一定程度上決定著白酒的質(zhì)量。目前，新建窖池擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模是企業(yè)提升競爭力的主要途徑。但由于新窖窖泥的老熟程度較低，釀酒有益微生物馴化程度不高[1]，導(dǎo)致新窖白酒的酒質(zhì)普遍較差。為促進(jìn)新窖窖泥老熟，近年來我國學(xué)者展開了一系列的研究[2-4]。如杜禮泉等[5]利用窖泥己酸菌研發(fā)的窖泥復(fù)合功能菌液對退化窖泥進(jìn)行改造，基礎(chǔ)酒己酸乙酯含量比改造前提高一倍，優(yōu)級品提高率達(dá)到32.83%，二級以上等級品提高率達(dá)到65.15%。前期，本課題組對人工窖泥復(fù)合功能菌液的配方進(jìn)行了研究[6-8]，經(jīng)過生產(chǎn)實踐，改窖后曲酒中己酸乙酯的含量達(dá)到210 mg/100 mL以上，相比對照窖提高近50%，優(yōu)質(zhì)酒品率達(dá)40%左右，顯著改善和提高濃香型白酒的質(zhì)量。但是，相關(guān)研究對菌液研究配方和應(yīng)用效果的較多，對功能菌液中微生物菌群結(jié)構(gòu)的研究較少，這使窖泥功能菌液的進(jìn)一步改進(jìn)缺乏理論依據(jù)。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）分析技術(shù)在白酒釀造過程中微生物群落分析方面已經(jīng)有了廣泛的應(yīng)用[9-13]。為了深入探討窖泥復(fù)合功能菌液的作用機(jī)理，本實驗利用變性梯度凝膠電泳分析不同處理的窖泥復(fù)合功能菌液在培養(yǎng)過程中細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)變化及其多樣性信息，以期為進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化窖泥復(fù)合功能菌液提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

窖泥、酒糟、黃水、大曲粉：四川省瀘州市某知名酒廠；純種己酸菌液：本實驗室培養(yǎng)；化學(xué)培養(yǎng)基（乙酸鈉1%、酵母膏0.1%、乙醇2%、磷酸二氫鉀0.04%、硫酸銨0.05%、硫酸鎂0.02%、碳酸鈣1%）、磷酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、苯酚、氯仿、異戊醇、NaAc、異丙醇（分析純）：成都科龍試劑有限公司；蛋白酶K（酶活力40 U/mg）：上海雅心生物技術(shù)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

K-2401-220型DGGE電泳儀：美國C.B.S.SCIENTIFIC公司；PTC-100型聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；SHA-C型數(shù)顯恒溫水浴振蕩器：上海雙捷實驗設(shè)備有限公司；SW-CG-1F型超凈工作臺：蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司；YX-18LM型壓力蒸汽滅菌器：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.3方法

1.3.1窖泥復(fù)合功能菌液的不同配方

將化學(xué)培養(yǎng)基、窖泥、酒糟、大曲粉、黃水、己酸菌進(jìn)行不同組合配比，其中A組為窖泥復(fù)合功能菌液（包括化學(xué)培養(yǎng)基、窖泥、酒糟、大曲粉、黃水、己酸菌6種組分）；B組為窖泥功能菌液不添加大曲粉；C組為窖泥功能菌液不添加酒糟；D組為窖泥功能菌液不添加窖泥；E組為窖泥功能菌液不添加己酸菌；F組為窖泥功能菌液不添加黃水，每個處理做3次重復(fù)，放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并在培養(yǎng)第15天采樣，分別研究這5個組分對復(fù)合功能菌液細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。

1.3.2窖泥總DNA提取

窖泥總DNA提取參考潘玲玲等[14]的方法并略加改進(jìn)，取0.5 g菌液沉淀于2 mL無菌的Eppendorf離心管中；加入1. 5mL磷酸提取液混勻，于-80℃冰箱冷凍30 min，65℃水浴融化，反復(fù)3次；加入10 μL蛋白酶K，于搖床37℃、220～250 r/min振蕩30 min；加入200 μL 20%SDS，65℃水浴2 h，每隔20 min將液體混合搖勻；室溫6 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入新的2 mL無菌離心管中；于上清中加0.5 mL體積分?jǐn)?shù)為50%的PEG，4℃靜置過夜；4℃、6 000 r/min離心30 min，棄上清，沉淀用1×TE溶解；加入0.5 mL苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1，V/V）抽提，12000r/min離心10min，重復(fù)抽提3次，上清轉(zhuǎn)移到新的無菌離心管中；加入50μL3mol/L的NaAc，300 μL異丙醇沉淀1 h，4℃、12 000 r/min離心20 min，棄上清；加入預(yù)冷的500 μL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇洗滌，于4℃、12 000 r/min離心20 min，棄上清，揮發(fā)1～3h；待乙醇完全揮發(fā)后，加入50 μL 1×TE溶解，于4℃保存。

1.3.3細(xì)菌16S rDNA基因PCR擴(kuò)增[15]

引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)。第一輪采用引物338f和518r，將DNA模板稀釋10倍后進(jìn)行擴(kuò)增，第二輪再將PCR一輪產(chǎn)物作為模板，采用引物338fgc和518r進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（30 μL）：ddH2O 13.4 μL，PremixTaqTM15 μL，引物（10 μmol/mL）各0.3 μL，模板DNA 1 μL。PCR反應(yīng)程序：92℃預(yù)變性2 min；92℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸6 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4擴(kuò)增產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳

對PCR第二輪產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳實驗。丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性范圍40%～60%。使用1×TAE緩沖液，50 V預(yù)跑30 min，再以180 V電泳7 h，銀染法染色，數(shù)碼相機(jī)拍照。采用Quantity One軟件對DGGE圖譜進(jìn)行分析，采用UPGMA算法對圖譜進(jìn)行聚類分析，生成樣品系統(tǒng)發(fā)育樹，得出群落結(jié)構(gòu)相似性指數(shù)（Sc）；測定圖譜條帶光強(qiáng)度，計算出多樣性指數(shù)（H）。

式中：Ni為DGGE圖譜中條帶i的光強(qiáng)度；N為所有條帶的光強(qiáng)度之和；Pi為某一條帶的強(qiáng)度與同泳道中所有條帶總強(qiáng)度的比值；S為每一泳道總的條帶數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1不同處理的窖泥復(fù)合功能菌液DGGE圖譜

不同處理的窖泥復(fù)合功能菌液DGGE圖譜見圖1。

圖1　不同處理的窖泥復(fù)合功能菌液DGGE圖譜Fig.1　DGGE spectrogram of composite functional microbe fluid in pit muds with different treatment

DGGE圖譜中不同位置上的條帶表示不同種的細(xì)菌，而相同位置上的條帶所對應(yīng)的細(xì)菌可理解為同一菌種；條帶的顏色深淺反應(yīng)了細(xì)菌的豐度，條帶顏色越深，說明該細(xì)菌的相對含量較大。由圖1可知，各個泳道細(xì)菌分離程度較好，分別得到10～25條數(shù)目不等的條帶。其中H1、H2是所有樣品共有條帶，但條帶數(shù)目差異較大，說明不同處理的窖泥復(fù)合功能菌液中細(xì)菌種類差異較大。

2.2不同處理的窖泥復(fù)合功能菌液細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性指數(shù)（Sc）分析

群落結(jié)構(gòu)相似性指數(shù)（Sc）表示在DGGE圖譜上不同樣本間相同位置上的條帶代表相同物種，相同物種的條帶數(shù)量反應(yīng)了樣本間菌群種類的相似程度，相似性指數(shù)（Sc）越小，表明樣本間群落結(jié)構(gòu)差異越大。不同處理的窖泥復(fù)合功能菌液細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性指數(shù)（Sc）結(jié)果見圖2。由圖2可知，窖泥復(fù)合功能菌液可分為2個大族，E1、F3、F2、C2、C3、E3、E2為第一族，其余樣品為第二族。其中處理C、處理E和處理F主要在第一族，而處理A在第二族，且兩個族的相似性指數(shù)（Sc）為0.34，表明處理C、處理E、處理F與處理A中細(xì)菌種類差異較大，說明了窖泥復(fù)合功能菌液中酒糟、己酸菌和黃水對該體系中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成貢獻(xiàn)較大。第二族中處理D與處理A相似性指數(shù)（Sc）為0.43，表明窖泥對該體系中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成具有一定的影響；處理B與處理A相似性指數(shù)（Sc）為0.56，表明大曲粉對窖泥復(fù)合功能菌液中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成影響不顯著。

圖2　不同處理的窖泥復(fù)合功能菌液細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性樹狀圖Fig.2　Dendrogram of bacterial diversity similarity of composite functional microbe fluid in pit muds with different treatment

2.3不同處理的窖泥復(fù)合功能菌液多樣性指數(shù)（H）分析

圖3　不同處理的窖泥復(fù)合功能菌液細(xì)菌多樣性指數(shù)(H)Fig.3　Bacterial diversity index(H)of composite functional microbe fluid in pit muds with different treatment

多樣性指數(shù)（H）主要是基于物種數(shù)量反應(yīng)群落種類多樣性，多樣性指數(shù)越高，窖泥復(fù)合功能菌液中的生物多樣性就越高。不同處理的窖泥復(fù)合功能菌液多樣性指數(shù)（H）結(jié)果見圖3。處理A的H值與處理B、處理D、處理F的H值相近，表明處理B、處理D、處理F與處理A中細(xì)菌多樣性相似（p＞0.05），說明窖泥復(fù)合功能菌液中減少曲藥、窖泥和黃水對窖泥復(fù)合功能菌液中細(xì)菌多樣性影響不明顯；而處理C和處理E的H值顯著低于處理A的H值（p＜0.05），表明處理C和處理E中細(xì)菌多樣性低于處理A，說明減少酒糟和己酸菌對窖泥復(fù)合功能菌液中細(xì)菌多樣性影響較大，且處理E的H值＜處理C的H值，則說明其對窖泥復(fù)合功能菌液的影響程度為己酸菌＞酒糟。己酸菌在釀酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的己酸，為己酸乙酯提供前體物質(zhì)。DGGE圖譜顯示，不加己酸菌的處理多樣性指數(shù)顯著下降，可能是由于己酸菌的某些代謝產(chǎn)物為其他細(xì)菌提供了營養(yǎng)物質(zhì)，有促進(jìn)細(xì)菌生長的作用，但具體作用機(jī)理還需進(jìn)一步研究。另外，酒糟是釀酒過程中微生物物質(zhì)能量交換的主要載體，在發(fā)酵過程中富集很多釀酒微生物，其代謝產(chǎn)物易累積在酒糟中，為細(xì)菌提供營養(yǎng)物質(zhì)，這可能是其顯著提高菌液細(xì)菌多樣性水平的原因之一。

3　結(jié)論

本實驗利用PCR-DGGE技術(shù)分析窖泥復(fù)合功能菌液中各組分對該體系中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響。根據(jù)不同處理的窖泥復(fù)合功能菌液細(xì)菌DGGE圖譜的相似性指數(shù)（Sc）和多樣性指數(shù)（H）分析。結(jié)果顯示，不同處理的窖泥復(fù)合功能菌液中細(xì)菌種類差異較大，其中酒糟、己酸菌和黃水對該體系中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成貢獻(xiàn)較大；酒糟和己酸菌對窖泥復(fù)合功能菌液中細(xì)菌多樣性影響較為顯著（p＜0.05），且己酸菌的影響程度最高，酒糟次之。

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Analysis of bacterial diversity of composite functional microbe fluid in pit muds by DGGE

LIU Ying1,2,LIU Maoke1,2,REN Daoqun1,2,YAO Wanchun1,2,TIAN Xinhui1,2,ZHANG Xingyu1,2,TANG Yuming1,2*
(1.Biotechlogy Center,Rice＆Sorghum Research Institute,Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Luzhou 646000,China; 2.Luzhou Liquor-making Science Research Institute,Luzhou 646000,China)

The effects of raw material(including pit muds,vinasse,Daqupowder,yellow water,caproic acid bacteria)of composite functional microbes fluid in pit muds on bacterial community were analyzed by denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE).The results of microbial diversity similarity analysis showed that the similarity coefficient(Sc)of bacterial diversity of the microbial liquid without vinasse,caproic acid bacteria and yellow water with pit muds composite functional microbial fluid was only 0.34.The results of diversity index analysis showed that the bacterial diversity index(H)of the microbial liquid without vinasse and caproic acid bacteria was decreased significantly(p＜0.05),and the bacterial diversity index (H)of the microbial liquid without caproic acid bacteria was the most obvious decrease.The results showed that the every component in pit muds composite functional microbes fluid had certain influence on bacterial diversity,and the influence of caproic acid bacteria was the greatest.The study provided theoretical basis for the improvement and optimization of formula of composite functional microbe fluid in pit muds.

composite functional microbe fluid in pit muds;bacterial diversity;DGGE

TS261.1；TS262.3

0254-5071（2016）10-0088-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.019

2016-05-19

四川省財政創(chuàng)新能力提升工程項目（2016QNJJ-019）

劉穎（1991-），女，研究實習(xí)員，研究方向為釀酒功能微生物。

唐玉明（1963-），男，研究員，碩士，研究方向為發(fā)酵工程。