張曉嵐

河北省眼科醫(yī)院耳鼻喉科，河北邢臺 054001

喉鱗狀細(xì)胞癌是頭頸部腫瘤中常見的惡性腫瘤，惡性度高，易發(fā)生局部復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及轉(zhuǎn)移的研究已經(jīng)成為了耳鼻咽喉-頭頸外科的研究熱點(diǎn)。細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶1（checkpoint kinase 1，CHK1）是在生物進(jìn)化過程中極為保守的蛋白激酶，研究表明CHK1 在人類許多惡性腫瘤中均有表達(dá)，可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)[1]。 RAD51 基因是細(xì)胞DNA 修復(fù)系統(tǒng)中的重要組成部分，研究表明RAD51 在人類許多惡性腫瘤中也呈高表達(dá)[2]。 本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測RAD51 及CHK1 在喉鱗狀細(xì)胞癌組織、對應(yīng)的癌旁正常黏膜組織及非喉部惡性腫瘤疾病患者的正常黏膜組織中的表達(dá)情況，并探討二者間的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料來源

收集2012 年1～12 月于河北省眼科醫(yī)院（以下簡稱“我院”）手術(shù)治療經(jīng)病理確診的喉鱗狀細(xì)胞癌患者50 例， 切取其喉鱗狀細(xì)胞癌組織及同一患者的癌旁正常黏膜組織50 例。 另收集同期我院手術(shù)治療的非喉部惡性腫瘤疾病（如聲帶息肉等）患者的喉部正常黏膜組織17 例。 喉鱗狀細(xì)胞癌患者中男47 例，女3 例；年齡46～79 歲，中位年齡59.5 歲；年齡≤59 歲12 例，年齡＞59 歲38 例；癌腫直徑≤2 cm 34 例，＞2 cm 16 例；分型：聲門上型17 例，聲門型32 例，聲門下型1 例；病理學(xué)分級：G1+G2級29 例，G3級21 例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期19 例，Ⅲ、Ⅳ期31 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（N+）29 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者（N0）21 例。 非喉部惡性腫瘤疾病患者中男12 例，女5 例；年齡42～76 歲，中位年齡56.2 歲。 喉鱗狀細(xì)胞癌患者與非喉部惡性腫瘤疾病患者的年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。 本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會通過，患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

采用免疫組織化學(xué)二步法。 標(biāo)本離體后1 h 內(nèi)采集，置入速凍管，迅速保存于-80℃冰箱內(nèi)。 將選取的50 例喉鱗狀細(xì)胞癌組織、對應(yīng)的50 例癌旁黏膜組織和17 例正常喉黏膜組織常規(guī)福爾馬林固定、石蠟包埋、4 μm 切片。實(shí)驗(yàn)試劑包括CHK1 兔抗人多克隆抗體、RAD51 兔抗人多克隆抗體、兔二抗免疫組化試劑盒、鼠二抗免疫組化試劑盒、DAB 顯色液。 用PBS 代替一抗孵育切片為空白對照。

1.3 結(jié)果判定

RAD51 及CHK1 陽性染色是細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色異染顆粒，周圍間質(zhì)部分有著色為準(zhǔn)，其中陽性染色結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率采用半定量積分法判斷分析結(jié)果[3]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。 相關(guān)性采用Spearman 相關(guān)性分析。 以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 喉鱗狀細(xì)胞癌組織、癌旁黏膜組織、正常黏膜組中RAD51、CHK1 陽性率情況

喉鱗狀細(xì)胞癌組織中RAD51 的陽性率明顯高于相對應(yīng)的癌旁黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝11.235，P ＝0.014）；也高于非喉部惡性腫瘤疾病患者的喉部正常黏膜組織，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝12.346，P ＝0.001）。 喉鱗狀細(xì)胞癌組織中CHK1 陽性率高于癌旁黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝9.235，P ＝0.041）；喉鱗狀細(xì)胞癌組織中CHK1 的陽性率高于正常黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝11.386，P ＝0.010）；癌旁組織中CHK1 的陽性率高于正常組織，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝1.245，P ＝0.612）。 見表1。

2.2 RAD51 及CHK1 在喉鱗狀細(xì)胞中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

2.2.1 RAD51 在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 N+的喉鱗狀細(xì)胞癌組織中RAD51 的陽性率高于N0，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。RAD51 在Ⅲ、Ⅳ期喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽性率明顯高于Ⅰ、Ⅱ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。 RAD51 在喉鱗狀細(xì)胞癌病理分級G1+G2級組織中的陽性率低于G3級，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。 RAD51 在吸煙量（支/d×年）＞400 和吸煙量≤400 的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。 RAD51 在腫瘤直徑≤2 cm 和腫瘤直徑＞2 cm的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。 RAD51 在喉鱗狀細(xì)胞癌的臨床分型中的聲門上型、聲門型、聲門下型的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。 RAD51在喉鱗狀細(xì)胞癌中年齡＞59 歲和年齡≤59 歲的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。 RAD51 在男、女性喉鱗狀細(xì)胞癌中的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。 說明RAD51 的陽性表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌的病理分級、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)，與吸煙量、腫瘤的大小、臨床分型、性別及年齡無關(guān)。

表2 喉鱗狀細(xì)胞癌組織中RAD51 陽性表達(dá)與臨床、病理特征的關(guān)系

2.2.2 CHK1 在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 CHK1 在有N+的喉鱗狀細(xì)胞癌組織中陽性率高于N0，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。CHK1 在Ⅲ、Ⅳ期陽性率明顯高于Ⅰ、Ⅱ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。 CHK1 在喉鱗狀細(xì)胞癌病理分級G1+G2級組織中陽性率低于G3級陽性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。CHK1 在吸煙量（支/d×年）＞400 和吸煙量≤400的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。 CHK1 在腫瘤直徑≤2 cm 和腫瘤直徑＞2 cm 的陽性率分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。 CHK1 在喉鱗狀細(xì)胞癌臨床分型有聲門上型、聲門型、聲門下型中的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。CHK1 在年齡＞59 歲和年齡≤59 歲的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。 CHK1 在男、女性喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。 說明CHK1 的陽性表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌的病理分級、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)，與吸煙量、腫瘤的大小、臨床分型、性別及年齡無關(guān)。見表3。

表3 喉鱗狀細(xì)胞癌組織中CHK1 陽性表達(dá)與臨床、病理特征的關(guān)系

2.3 喉鱗狀細(xì)胞癌組織中RAD51 表達(dá)與CHK1 表達(dá)的關(guān)系

經(jīng)Spearman 相關(guān)分析顯示喉鱗狀細(xì)胞癌組織中RAD51 的表達(dá)與CHK1 的表達(dá)呈正相關(guān)（r ＝0.432，P ＜0.01）。 見表4。

表4 喉癌組織中RAD51 表達(dá)與CHK1 表達(dá)的關(guān)系

3 討論

喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病的重要機(jī)制之一是某些因素破壞了細(xì)胞的增殖、修復(fù)與凋亡之間的平衡。 研究表明腫瘤細(xì)胞的耐藥與其逃避凋亡及DNA 的過度修復(fù)有關(guān)，而細(xì)胞的凋亡與細(xì)胞周期檢測點(diǎn)調(diào)節(jié)有關(guān)[4]。在細(xì)胞周期檢測點(diǎn)的調(diào)節(jié)中，CHK1 起著非常重要的作用，RAD51 是體內(nèi)參與同源重組DNA 修復(fù)的關(guān)鍵酶之一[5]。研究發(fā)現(xiàn)CHK1 和RAD51 在多種惡性腫瘤中表達(dá)均高于正常組織，因此檢測喉鱗狀細(xì)胞癌組織中CHK1 和RAD51 有助于為喉鱗狀細(xì)胞癌的臨床治療、評估喉鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后提供依據(jù)。

3.1 RAD51 表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌間的關(guān)系

人類的RAD51 蛋白主要功能是參與了DNA 雙鏈的修復(fù)和重組，在DNA 雙鏈進(jìn)行鏈間轉(zhuǎn)移置換時(shí)，RAD51 是催化此過程的關(guān)鍵酶。 研究發(fā)現(xiàn)RAD51 水平下降降低了同源重組修復(fù)DNA 雙鏈的準(zhǔn)確性，破壞了其他重組修復(fù)途徑，使DNA 損傷檢查點(diǎn)平衡失調(diào)，引起基因組的不穩(wěn)定，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生，說明RAD51 蛋白表達(dá)水平的失調(diào)促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6-9]。 許俊[10]采用免疫組化SP 法檢測60 例肺鱗狀細(xì)胞癌組織RAD51 蛋白陽性率（33.33%）明顯高于15 例癌旁正常組織中RAD51 蛋白陽性表達(dá)（6.67%）。本研究結(jié)果與上述研究一致。 本研究顯示：RAD51 在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽性率明顯高于癌旁黏膜組織及正常喉黏膜組織，提示RAD51 在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的高表達(dá)可能與喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。且RAD51 在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系顯示：喉鱗狀細(xì)胞癌晚期有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，RAD51的表達(dá)增強(qiáng)，低中分化RAD51 的表達(dá)增強(qiáng)，而在高分化中的表達(dá)相對較弱，病理分化程度越低RAD51 表達(dá)越強(qiáng)，說明RAD51 的表達(dá)越弱腫瘤的惡性程度就越低。 RAD51 還在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中有著高表達(dá)，提示它可能影響了腫瘤的轉(zhuǎn)移，RAD51 表達(dá)越高預(yù)后越差[13-14]。

3.2 CHK1 表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌之間的關(guān)系

CHK1 是一種調(diào)控基因，主要參與了細(xì)胞周期中G2/M 期的調(diào)控。 當(dāng)細(xì)胞的DNA 雙鏈發(fā)生損傷后，CHK1 激活一系列過程，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯。 它同時(shí)還激活了DNA 損傷的修復(fù)系統(tǒng)， 最終維護(hù)細(xì)胞的穩(wěn)定性，從而使細(xì)胞能夠正常的增殖分化，避免了細(xì)胞的凋亡[15-16]。 本研究結(jié)果表明：CHK1 在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽性率明顯高于癌旁黏膜組織及非喉部惡性腫瘤的正常黏膜組織，但后二者表達(dá)無差異，提示CHK1 在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)可能與喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。 申帥[17]的研究表明CHK1蛋白表達(dá)有隨Dukes 分期提升而提高的傾向，癌組織與癌旁正常組織中CHK1 蛋白的表達(dá)有顯著差異，提示CHK1 與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有密切關(guān)系。本研究CHK1 在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系顯示：喉鱗狀細(xì)胞癌到了晚期有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)，CHK1 的表達(dá)明顯增強(qiáng)，在低中分化中CHK1 的表達(dá)增強(qiáng)，而在高分化中的表達(dá)相對較弱，病理分化程度越低CHK1 表達(dá)越強(qiáng)，說明CHK1 表達(dá)越強(qiáng)腫瘤的惡性程度就越高。 CHK1 還在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中明顯高表達(dá)，說明它可能會影響腫瘤的轉(zhuǎn)移，而有轉(zhuǎn)移的腫瘤預(yù)后較差，進(jìn)一步說明了通過監(jiān)測CHK1 的表達(dá)可能可以預(yù)測腫瘤的預(yù)后。

3.3 RAD51 及CHK1 在喉鱗狀細(xì)胞癌中二者表達(dá)的相關(guān)性

本研究發(fā)現(xiàn)RAD51 及CHK1 在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中均為高表達(dá)，且RAD51 及CHK1 間呈正相關(guān)，但具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，RAD51 及CHK1 共同參與了喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生及發(fā)展過程，二者可以作為惡性腫瘤的分期分級和判斷惡性程度的標(biāo)志，研究其表達(dá)可以為腫瘤患者的預(yù)后提供依據(jù)。

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