李 克， 吳龍琴， 湯 淏， 王曙東

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院， 江蘇 南京 210002)

忍冬藤LoniceraeJaponicaeCaulis系常用中藥，含有多種有機(jī)酸。其中咖啡酸、綠原酸具有降血壓、降血糖、抗菌、抗病毒以及抗氧化等多種藥理活性[1-4]，是評(píng)價(jià)忍冬藤藥材質(zhì)量的主要有效成分指標(biāo)。

傳統(tǒng)的忍冬藤有效成分提取工藝多為水煎法，該工藝的不足在于提取時(shí)間過長、耗能較大。微波輔助萃取(Microwave Assisted Extraction，MAE)，又稱微波萃取(Microwave Extraction，ME)是微波和傳統(tǒng)的溶劑萃取法相結(jié)合而成的一種萃取方法。自1986年首先提出后[5]，因其具有設(shè)備要求較低、操作方便、提取效率高、能耗小以及成本低等特點(diǎn)，在中草藥有效組分提取領(lǐng)域呈現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，成為一種有發(fā)展?jié)摿Φ奶崛⌒鹿に嘯6-11]。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法檢測(cè)，以忍冬藤中有效成分綠原酸、咖啡酸為考察指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化并選定了忍冬藤藥材的微波輔助萃取提取工藝，并與超聲提取法以及水提醇沉法等工藝進(jìn)行了比較。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀系統(tǒng)由二極管陣列檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、 二元高壓泵及色譜工作站組成(Waters公司)；EM-309EBI微波加熱裝置(南京三樂微波技術(shù)發(fā)展有限公司)。冷凝回流提取裝置、真空泵、WH-3旋渦混合器(上海滬西儀器廠)。

綠原酸、咖啡酸對(duì)照品均購自中國藥品生物制品檢定所。乙腈為色譜純，95 %乙醇為工業(yè)級(jí)，其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水使用超純凈水。微孔濾膜購自南京中東化玻儀器公司。

忍冬藤供試藥材購自南京藥業(yè)股份有限公司，產(chǎn)地為我國山東。經(jīng)鑒定為忍冬科植物忍冬的干燥莖枝。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液制備 準(zhǔn)確稱取綠原酸、咖啡酸對(duì)照品各10 mg，以50%甲醇溶解后，分別移至10 mL量瓶中定容至刻度，搖勻，置4 ℃冰箱避光保存，即為對(duì)照品貯備液。工作液以貯備液稀釋配制。

2.2 樣品提取及制備

2.2.1 超聲提取法[12]精密稱取經(jīng)干燥粉碎忍冬藤粉末(過10目篩)約1 g，置25 mL的量瓶中，加50%甲醇定容，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放置冷卻至室溫。再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，按照色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。

2.2.2 水提醇沉法 按文獻(xiàn)[13]稱取經(jīng)粉碎、干燥藥材于圓底燒瓶中，加水煎煮提取3次。合并藥液，靜置，冷卻，過濾。取濾液加95%乙醇醇沉，過濾。取續(xù)濾液，經(jīng)微孔濾膜過濾后進(jìn)樣測(cè)定。

2.2.3 微波輔助萃取法 按制定工藝條件，精確稱取經(jīng)粉碎(過10目篩)、干燥忍冬藤藥材約10 g進(jìn)行提取。合并藥液，冷卻后過濾。取濾液加體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇(1∶2)醇沉40 min，過濾。取續(xù)濾液，經(jīng)0.2 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣測(cè)定。

2.3 綠原酸、咖啡酸測(cè)定 按文獻(xiàn)[14]以HPLC法測(cè)定忍冬藤中綠原酸、咖啡酸的量。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗(yàn) 分別考察了微波功率和提取時(shí)間兩個(gè)單一因素對(duì)忍冬藤藥材微波輔助提取工藝的影響，以確定正交試驗(yàn)的適宜選擇范圍。

3.1.1 微波功率對(duì)提取得率的影響 平行稱取忍冬藤粉末3組，每組各4份，每份各約10 g，固定萃取條件為20倍水，提取2次，每次3 min，分別考察功率為400、500、600、700 W時(shí)對(duì)提取效果的影響。圖1結(jié)果顯示，隨著功率的增大，綠原酸、咖啡酸提取得率呈增加趨勢(shì)，當(dāng)功率達(dá)到700 W時(shí)，綠原酸和咖啡酸得率達(dá)到最大。由于實(shí)驗(yàn)設(shè)備條件所限，其最大功率只能700 W，若繼續(xù)增加功率，兩者得率可能還會(huì)增加。

圖1 微波功率對(duì)提取得率的影響(n=3)

3.1.2 提取時(shí)間對(duì)提取得率的影響 平行稱取忍冬藤粉末3組，每組各6份，每份各約10 g，固定萃取條件為功率600 W，20倍水，提取2次，每次提取時(shí)間分別為1、2、3、4、5、7 min，考察不同提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響。由圖2結(jié)果可知，在提取時(shí)間為4 min之前提取量隨時(shí)間的增加而提高，4 min之后繼續(xù)增加提取時(shí)間對(duì)提取含量的影響不大。

圖2 提取時(shí)間對(duì)提取得率的影響(n=3)

3.2 微波提取工藝正交試驗(yàn)

3.2.1 因素與水平確定 基于上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)確定以微波功率、提取液與藥材液固比、提取時(shí)間以及提取次數(shù)4個(gè)對(duì)忍冬藤微波提取工藝影響較大的因素作為考察對(duì)象，以綠原酸和咖啡酸提取得率為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，因素與水平見表1。

表1 因素與水平

3.2.2 正交試驗(yàn)及方差分析 制備9份樣品，分別按表1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行微波提取。以綠原酸和咖啡酸提取量為考察指標(biāo)進(jìn)行直觀分析和方差分析，結(jié)果見表2～表4。

從表2結(jié)果直觀分析，各因素對(duì)綠原酸和咖啡酸影響順序?yàn)镈>C>B>A，以功率為誤差所在列進(jìn)行方差分析，得出C、D因素差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。最佳工藝應(yīng)為A2B3C2D3，即功率600 W，24倍水，微波提取3次，每次4 min。參考微波功率對(duì)提取效果的單因素影響，實(shí)驗(yàn)選定最佳工藝為A3B3C2D3，即功率700 W，24倍水，微波提取3次，每次4 min。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 綠原酸方差分析

表4 咖啡酸方差分析

3.3 不同提取工藝比較及驗(yàn)證 實(shí)驗(yàn)選定最佳工藝條件未包括在正交設(shè)計(jì)表的9次試驗(yàn)中，因此對(duì)A3B3C2D3優(yōu)選條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，并與“2.2樣品提取及制備”項(xiàng)文獻(xiàn)報(bào)道所優(yōu)選出的水提醇沉法工藝及超聲提取工藝進(jìn)行比較。結(jié)果見表5。

表5 不同提取方法提取忍冬藤中綠原酸和咖啡酸結(jié)果比較(n=3)

結(jié)果顯示，正交優(yōu)化后的微波輔助提取工藝和水提醇沉工藝對(duì)忍冬藤中綠原酸和咖啡酸提取率相近，且均明顯高于超聲提取法。但相比之下，微波輔助提取工藝可大大縮短提取時(shí)間，有效提高提取效率。具有明顯的快速、簡便、低耗、環(huán)保等優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，微波輔助提取工藝可有效地克服傳統(tǒng)煎煮提取方法中藥材細(xì)粉易出現(xiàn)糊化、堵塞等問題，適宜于工業(yè)化大生產(chǎn)[15]。

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