劉彩艷， 宋 英， 胡 清， 談 靜， 賀寶瑩

(1.成都中醫(yī)藥大學，四川 成都 610075；2. 成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，四川 成都 610072)

近年來，糖尿病較高的發(fā)病率引起人們的廣泛關(guān)注。對于糖尿病的治療，目前主要以注射胰島素控制血糖水平，中藥制劑在治療消渴方面尚處于研究階段。三才降糖顆粒由人參、黃連、肉桂、地黃、天冬五味藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、調(diào)理陰陽、平定寒熱等功效，用于治療消渴病陰津虧耗，燥熱偏盛所致氣陰兩虛證。本實驗通過建立定性、定量法對產(chǎn)品進行研究，采用薄層色譜(TLC)法對顆粒劑中的肉桂進行定性鑒別；同時采用高效液相色譜(HPLC)法對顆粒劑中的人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、梓醇、鹽酸小檗堿進行定量測定，為三才降糖顆粒質(zhì)量標準的建立提供實驗依據(jù)，同時為醫(yī)院制劑新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

HP-1100型高效液相色譜儀；BP211D電子分析天平(十萬分之一，德國SARTORIUS公司)；人參皂苷Rg1對照品(110703-201027)、人參皂苷Re對照品(110754-201023)、人參皂苷Rb1對照品(110704-200921)、鹽酸小檗堿對照品(110713-200911)、桂皮醛對照品(110710-201016)、梓醇對照品(110808-201009)、肉桂對照藥材(121363-200401)均由中國藥品生物制品檢定所提供；三才降糖顆粒(15g/袋)由成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科自制。乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 肉桂的薄層色譜鑒別[1]

取本品10 g，加乙醇30 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)20 min，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。取缺肉桂陰性樣品10 g，按上述方法制備陰性供試品溶液。另取肉桂對照藥材0.5 g，加乙醇10 mL，按上述方法制備肉桂對照藥材溶液。再取桂皮醛對照品，加乙醇制成每1 mL含0.05 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗，吸取供試品溶液、陰性供試品溶液、對照藥材溶液各10 μL、對照品溶液2 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(17∶3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以二硝基苯肼乙醇試液。供試品色譜在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性無干擾，見圖1。

圖1 肉桂TLC圖譜

3 樣品中成分測定

3.1 人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、梓醇的測定[2-7]

3.1.1 色譜條件 Phenomenex C18(2)(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；以乙腈為流動相A，水為流動相B，按表1中的規(guī)定進行梯度洗脫；體積流量1 mL/min；柱溫20 ℃；檢測波長203 nm，理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計算應(yīng)不低于6 000。

表1 梯度洗脫

3.1.2 供試品溶液制備 取樣品，研細，取約2 g，加甲醇30 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水30 mL溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次30 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次30 mL，再用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次30 mL，分取正丁醇液，蒸干，殘渣用甲醇適量使溶解，移置10 mL量瓶，加甲醇定容，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.1.3 對照品溶液制備 精密稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、梓醇對照品適量，置25 mL量瓶中，加甲醇配成每1 mL含人參皂苷Rg10.804 8 mg、人參皂苷Re 0.786 0 mg、人參皂苷Rb10.846 8 mg、梓醇0.1256 mg的混合對照品溶液。

3.1.4 陰性供試品溶液制備 按制劑處方比例和方法，制備缺人參及地黃的陰性樣品，按“供試品溶液”制備方法制成缺人參及地黃的陰性供試品溶液。

3.1.5 系統(tǒng)適用性試驗 取上述混合對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液，按上述色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果待測峰與其他峰分離度良好，陰性樣品在混合對照品相同保留時間位置上未見色譜峰，表明陰性無干擾，見圖2。

圖2 人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、梓醇 HPLC色譜圖

3.1.6 線性關(guān)系考察 精密吸取上述混合對照品溶液0.5、1、3、5、10 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，精密吸取各對照品溶液10 μL進樣，按上述色譜條件分別測定峰面積，以峰面積為縱坐標，對照品進樣量為橫坐標進行線性回歸，計算回歸方程。結(jié)果見表2。

表2 線性回歸方程(n=5)

3.1.7 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，按上述色譜條件重復進樣6次。計算人參皂苷Rg1平均峰面積為1 345.3，RSD為2.14%；人參皂苷Re平均峰面積為1 238.9，RSD為1.26%；人參皂苷Rb1平均峰面積為988.4，RSD為1.06%；梓醇平均峰面積為321.4，RSD為1.37%。表明儀器精密度良好。

3.1.8 穩(wěn)定性試驗 分別取同一供試品溶液，精密吸取10 μL，于0、2、4、8、10、12 h注入液相色譜儀，按上述色譜條件分別測定。計算人參皂苷Rg1的平均值為0.48 mg/g，RSD為1.04%；人參皂苷Re的平均值為1.41 mg/g，RSD為1.58%；人參皂苷Rb1的平均值為2.84 mg/g，RSD為0.72%；梓醇的平均值為0.27 mg/g，RSD為2.24%。結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.9 重復性試驗 取同一批樣品(批號20120912)，研細，取約2 g，精密稱定，按“3.1.2”項下方法制備供試品溶液，共6份。精密吸取上述供試品溶液和混合對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件分別測定，計算人參皂苷Rg1的平均值為0.46 mg/g，RSD為1.54%；人參皂苷Re的平均值為1.36 mg/g，RSD為1.87%；人參皂苷Rb1的平均值為2.79 mg/g，RSD為2.01%；梓醇的平均值為0.28 mg/g，RSD為2.05%。

3.1.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知含有量的樣品(批號20120912)1g， 共9份， 分別精密加入對照品溶液(人參皂苷Rg10.155 6 mg/mL、 人參皂苷Re 0.462 1 mg/mL、 人參皂苷Rb10.918 4 mg/mL、 梓醇0.091 2 mg/mL)2.4、3.0、3.6 mL，按“3.1.2”項下方法制備高、中、低質(zhì)量濃度的供試品溶液。分別精密吸取上述供試品溶液和對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件分別測定，計算平均加樣回收率，結(jié)果見表3。

3.1.11 樣品測定 取3批樣品，分別按“3.1.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取上述供試品溶液和對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件分別測定，計算，結(jié)果見表4。

3.2 鹽酸小檗堿的測定[7-9]

改革開放的總設(shè)計師鄧小平同志曾說過:“中國的改革是從農(nóng)村開始的，農(nóng)村的改革是從安徽開始的”。1978年召開的中共十一屆三中全會和小崗村的“大包干”創(chuàng)舉，開啟了農(nóng)村改革(包產(chǎn)到戶農(nóng)業(yè)生產(chǎn)責任制)的新進程，開創(chuàng)了改革發(fā)展新局面。[1]隨著1982年家庭聯(lián)產(chǎn)承包責任制在農(nóng)村的基本普及、1982—1986年中央5個“一號文件”的連續(xù)下發(fā)、鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè)的蓬勃發(fā)展和農(nóng)業(yè)剩余勞動力的外出務(wù)工，吃飯的問題逐步得以解決，計劃經(jīng)濟體制也逐步向商品經(jīng)濟體制、市場經(jīng)濟體制轉(zhuǎn)化，開始了建設(shè)中國特色社會主義的新探索。[1]

3.2.1 色譜條件 Hypersil ODS2色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流動相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(50∶50)(每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長345 nm，理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計算應(yīng)不低于5 000。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)

表4 樣品測定結(jié)果(n=3)

3.2.2 對照品溶液制備 精密稱取鹽酸小檗堿對照品16.34 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得。

3.2.3 供試品溶液制備 取樣品，研細，取約0.3 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加鹽酸-甲醇(1∶100)的混合溶液，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，用鹽酸-甲醇(1∶100)的混合溶液定容，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為鹽酸小檗堿供試品溶液。

3.2.4 陰性供試品溶液制備 按制劑處方比例和方法，制備缺黃連的陰性樣品，按“供試品溶液”制備方法分別制成缺黃連的陰性供試品溶液。

3.2.5 系統(tǒng)適用性試驗 取上述對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液，按上述色譜條件進樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果待測峰與其他峰分離度良好，陰性樣品在對照品相同保留時間位置上未見色譜峰，表明陰性無干擾，見圖3。

A.對照品 B.樣品 C.陰性樣品 1.鹽酸小檗堿A.reference substance B.sample C.negative sample 1.berberine hydrochloride

3.2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液0.1、1、2、5、10 mL置10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，精密吸取各對照品溶液5 μL進樣，按上述色譜條件分別測定峰面積，以峰面積為縱坐標，對照品進樣量為橫坐標進行線性回歸，計算回歸方程。得回歸方程：y=2351.7x-3.112，r=1.000 0。結(jié)果表明鹽酸小檗堿在0.032 68～3.268 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2.7 精密度試驗 取鹽酸小檗堿對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣6次。計算鹽酸小檗堿平均峰面積為1 481.37，RSD為0.91%，表明儀器精密度良好。

3.2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，于0、2、4、6、8、10 h注入液相色譜儀，按上述色譜條件分別測定。計算鹽酸小檗堿的平均值為16.05 mg/g，RSD為0.35%，結(jié)果表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.9 重復性試驗 取同一批樣品(批號20120912)，研細，取約0.3 g，精密稱定，按“3.2.3”項下方法制備供試品溶液，共6份。精密吸取上述供試品溶液和對照品溶液各5 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件分別測定，計算鹽酸小檗堿的平均值為16.14 mg/g，RSD為0.47%，表明該方法重復性良好。

3.2.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知含有量的樣品(批號20120912)0.15 g，共9份，分別精密加入鹽酸小檗堿對照品溶液(2.451 9 mg/mL)0.8、1.0、1.2 mL，按“3.2.3”項下方法制備高、中、低質(zhì)量濃度的供試品溶液。分別精密吸取上述供試品溶液和對照品溶液5 μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件分別測定，計算平均加樣回收率，結(jié)果見表5。

表5 鹽酸小檗堿加樣回收率試驗結(jié)果

3.2.11 樣品測定 取3批樣品，分別按“3.2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件分別測定，計算結(jié)果見表6。

4 討論

4.1 糖尿病是一組由于胰島素分泌缺陷和/或胰島素作用障礙所致的以高血糖為特征的代謝性疾病，中醫(yī)將其歸于消渴病的范疇。祖國醫(yī)學治療消渴有悠久的歷史和顯著的特色優(yōu)勢。關(guān)于本病的病機，古人將其總結(jié)為“陰虛為本，燥熱為標”。因此，“三才降糖”在古方“三才湯”合“連梅湯”的基礎(chǔ)上進行化裁，巧妙的將人參之甘與黃連之苦、肉桂之辛有機的結(jié)合起來，而合古人“苦甘堅陰”、“辛甘化陽”之法。誠如張景岳在《新方八略引》中所言：“善補陽者，必于陰中求陽，則陽得陰助而生化無窮；善補陰者，必于陽中求陰，則陰得陽升而泉源不竭?！?/p>

表6 樣品測定結(jié)果(n=3)

4.2 處方中人參具有大補元氣、復脈固脫、益氣攝血功效，是目前治療糖尿病的常用中藥。其降糖成分主要為人參皂苷和人參多糖。參考相關(guān)文獻[10]，人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1對心血管、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫功能等具有廣泛的藥理作用。黃連主要含小檗堿型生物堿，其中鹽酸小檗堿是其降糖主要有效成分[11]。地黃主要含糖類、環(huán)烯醚萜及其苷類化合物，梓醇為環(huán)烯醚萜類的代表，具有降糖作用[12]。故以人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、鹽酸小檗堿、梓醇的量作為控制本品質(zhì)量的指標成分。

4.3 參照《中國藥典》2010年版一部，人參皂苷與梓醇均為末端吸收，考慮采用梯度洗脫的方法，在203、210 nm檢測波長下同時測定人參皂苷與梓醇的量。結(jié)果人參皂苷的測定中，210 nm下測定值約為203 nm下的40%；梓醇的測定中，與210 nm下的測定值相比，203 nm下略微降低，故梯度洗脫檢測波長選擇203 nm。

4.4 在鹽酸小檗堿的測定中，分別采用50%甲醇、甲醇、50%乙醇、乙醇、鹽酸-甲醇(1∶100)、鹽酸-乙醇(1∶100)作為提取溶劑，結(jié)果鹽酸-甲醇(1∶100)溶液提取的鹽酸小檗堿量較高，且色譜圖顯示雜質(zhì)少；同時還考察了10、20、30、40、50 min不同提取時間對樣品的影響，結(jié)果提取時間為30 min時，已經(jīng)基本提取完全。故選擇鹽酸-甲醇(1∶100)溶液作為供試品溶液制備的溶劑，提取時間為30 min。

本方法簡便、準確、重復性好，可有效地控制產(chǎn)品的質(zhì)量，為三才降糖顆粒質(zhì)量標準的建立提供參考。

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