馮蕭蕭(綜述)，劉 海(審校)

(云南省第二人民醫(yī)院眼科中心，昆明 650000)

羊膜從細胞滋養(yǎng)層演化而來，是人類兩層胎膜的內(nèi)層，為人體中最厚的基膜。自1910年，Divis首次把胎膜(羊膜+絨毛膜)用于移植取得成功后，羊膜被廣泛用于醫(yī)學臨床研究中。隨后，Kim等[1]在化學燒傷模型的角膜表面成功進行羊膜移植，羊膜對重建眼表的作用逐漸引起眼科醫(yī)師的重視。現(xiàn)今成熟的現(xiàn)代化組織制備技術(shù)使羊膜的材料性能得到不斷地提高和改善，羊膜的開發(fā)和應(yīng)用也不斷向前發(fā)展。尤其在眼科的應(yīng)用中，羊膜不僅局限于作為組織移植材料，也被廣泛應(yīng)用于細胞培養(yǎng)載體、分子生物篩、膜控釋藥系統(tǒng)等基礎(chǔ)研究中。

1 羊膜的生物特性

1.1羊膜的組織結(jié)構(gòu)特點 肉眼下羊膜薄而透明。光鏡下羊膜自外向內(nèi)分為5層[2]：上皮細胞層、基膜、致密層、纖維母細胞層和海綿層。①上皮細胞層：為單層立方上皮，有合成、分泌和沉積基膜和細胞外間質(zhì)成分的能力。②基膜：由網(wǎng)狀纖維構(gòu)成，含Ⅳ形膠原纖維網(wǎng)，層粘連蛋白和硫肝糖蛋白等。③致密層：由網(wǎng)織纖維組成，與基膜緊密聯(lián)接，決定了羊膜的張力能力。④纖維母細胞層，由纖維母細胞及網(wǎng)狀纖維組成，是組成羊膜厚度的主要部分。⑤海綿層，由波浪狀的網(wǎng)狀纖維束組成，具有伸展性。電鏡下，羊膜上皮細胞外側(cè)面有大量微絨毛結(jié)構(gòu)，上皮細胞間由橋粒和半橋粒相連，形成復雜的迷路型管道系統(tǒng)，基膜上的半橋粒結(jié)構(gòu)非常豐富，含有微纖維[3-4]。目前臨床上所用的羊膜植片通常只含有上皮細胞層、基底層和致密層結(jié)構(gòu)。

1.2羊膜的免疫特點

1.2.1羊膜的低抗原性 Adinolfi等[5]研究發(fā)現(xiàn)，羊膜不表達人類白細胞抗原Ⅱ(human leucotyte antigenⅡ，HLA-Ⅱ)類抗原，含少量的人類白細胞抗原(HLA-A,B,C)和人類白細胞抗原-DR(HLA-DR)抗原以及B9-微球蛋白，抗原性極低。Kubo等[6]對凍存羊膜的免疫原性進行了研究，發(fā)現(xiàn)在異種移植中，羊膜在免疫赦免組織內(nèi)不引起排斥反應(yīng)，而在非免疫赦免組織中僅具有相對的免疫原性，同時發(fā)現(xiàn)羊膜具有能在體外抑制免疫活性的Fas配體陽性細胞，說明羊膜具有減少免疫細胞來源、避免免疫排斥反應(yīng)的作用。華萍等[7]通過建立BALB/c小鼠皮下移植實驗模型，分析外周血CD3+、CD25+和CD3+、CD21+表達水平及免疫組織化學法定量監(jiān)測組織切片中CD3+、CD4+、CD8+、主要組織相容性復合體Ⅱ的表達水平，得出凍干羊膜和新鮮羊膜行體內(nèi)移植后，均表現(xiàn)出極低的免疫原性，不會引起由T細胞介導的特異性排斥反應(yīng)，具有良好的組織相容性。

1.2.2羊膜可分泌大量細胞因子 Imakawa等[8]研究發(fā)現(xiàn)，羊膜可分泌大量的細胞因子，如表皮生長因子、肝細胞生長因子、角質(zhì)細胞生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子(神經(jīng)營養(yǎng)素、神經(jīng)細胞分裂素、成纖維細胞生長因子、膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、胰島素樣生長因子等)、轉(zhuǎn)化生長因子β(轉(zhuǎn)化生長因子β1、轉(zhuǎn)化生長因子β2、轉(zhuǎn)化生長因子β3)、堿性成纖維細胞生長因子等及其相應(yīng)的信使RNA等成分。Hao等[9]通過反轉(zhuǎn)錄PCR和免疫組織化學法發(fā)現(xiàn)，羊膜上皮和間質(zhì)細胞可以表達多種抗血管形成因子和抗炎蛋白，包括白細胞介素1受體、白細胞介素10、內(nèi)皮抑制素前體蛋白，金屬蛋白酶組織抑制因子和血小板反應(yīng)蛋白1等，這些因子作用于眼部可釋放各種抗炎和抗血管因子。

2 羊膜在眼科領(lǐng)域的應(yīng)用

2.1羊膜手術(shù) 在眼科臨床中，羊膜主要作為生物基膜進行移植。根據(jù)手術(shù)目的及所希望達到的治療效果羊膜手術(shù)大致可分為羊膜移植術(shù)、羊膜遮蓋術(shù)及羊膜充填術(shù)。羊膜移植術(shù)的主要目的是使急性損傷的角膜眼表或缺損的結(jié)膜區(qū)能夠迅速上皮化，如眼表化學性燒傷及眼表熱燒傷[10]、Steven-Johnson綜合征[11]、神經(jīng)麻痹性角膜病變[12]和準分子激光屈光性角膜手術(shù)后角膜受損[13-14]、眼表腫瘤[15]等。羊膜遮蓋術(shù)主要應(yīng)用于治療瞼球粘連[16]等大面積的眼表病變，目的是維持眼表穩(wěn)定，重建眼表結(jié)構(gòu)；羊膜充填術(shù)則多應(yīng)用于眼肌損傷的修復[17]、非感染性角膜及鞏膜的潰瘍或穿孔[18]及難治性青光眼術(shù)后濾過口的粘連[19]等。

2.2羊膜可作為細胞培養(yǎng)的載體 羊膜上帶有活性細胞，并可分泌多種細胞因子，使其成為一種理想的支持細胞生長的載體。Dobrowolski等[20]將羊膜作為載體進行角膜緣上皮細胞的自體培養(yǎng)，并進行移植，初步取得滿意效果。Fan等[21]采用去除自身上皮細胞的羊膜基膜作為培養(yǎng)載體，種植非轉(zhuǎn)染人角膜內(nèi)皮細胞，通過體外培養(yǎng)擴增的方法成功培育出具有活性的角膜內(nèi)皮細胞株。實驗證明，羊膜基膜是角膜內(nèi)皮細胞生長和移植的良好載體，體外培養(yǎng)的角膜內(nèi)皮細胞移植有望替代供體角膜移植，具有廣闊的應(yīng)用前景。Akrami等[22]以羊膜作為培養(yǎng)液，體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜色素上皮細胞，通過檢測多種細胞因子及基因表達，發(fā)現(xiàn)羊膜可選擇性地作為視網(wǎng)膜色素上皮細胞培養(yǎng)的載體。

2.3羊膜細胞可被體外誘導分化 人羊膜上皮細胞具有干細胞的性質(zhì)，擁有和胚胎干細胞同樣的表面標記蛋白，也擁有Oct-4和Nanog基因，是角膜組織工程的理想“種子細胞”。張仁禮等[23]首先將小鼠胚胎干細胞與人羊膜共培養(yǎng)4～5 d，發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞分化為表皮細胞樣的單層細胞，結(jié)果顯示，人羊膜組織可在體外誘導分化為表皮樣干細胞。Fatimah等[24]將經(jīng)胰蛋白酶消化后的羊膜上皮細胞種植于含有多種細胞因子及誘導液的培養(yǎng)液中，經(jīng)連續(xù)傳代(4代)后發(fā)現(xiàn)羊膜上皮細胞具有分化為角膜上皮細胞的潛能。周清等[25]和劉小勇等[26]利用角膜基質(zhì)作為載體誘導人羊膜上皮細胞分化，得到了在形態(tài)結(jié)構(gòu)以及在角膜上皮特異性表面標志蛋白CK3/12的表達上均類似角膜上皮細胞的細胞，表明人羊膜上皮細胞在角膜基質(zhì)的調(diào)控下可向角膜上皮細胞分化。

2.4羊膜可作為眼科藥物的緩釋藥膜 羊膜是一種優(yōu)良的組織工程材料，Kim等[27]認為羊膜可作為有效的藥物釋放系統(tǒng)，提高藥物在淚液中的質(zhì)量濃度。蔡明銘等[28]將更昔洛韋與纖維蛋白膠混合后與羊膜黏合，制成更昔洛韋-纖維蛋白膠-羊膜復合物，研究發(fā)現(xiàn)不論體內(nèi)或體外條件下，更昔洛韋-纖維蛋白膠-羊膜復合物均具有良好的緩釋特性，可成為治療病毒性角膜炎的新手段。周文君等[29]將纖維蛋白膠交聯(lián)羊膜和表皮生長因子/殼聚糖納米粒復合，構(gòu)建一種新型的無縫合、可移植同時能有效緩釋蛋白藥物的復合生物材料(rhEGF/CS-FBAM)，成功應(yīng)用于眼表創(chuàng)傷修復。李小丹等[30]將兩性霉素B脂質(zhì)體與纖維蛋白膠混合，再與羊膜膠聯(lián)，制備成兩性霉素B脂質(zhì)體膠聯(lián)羊膜的藥膜。將藥膜移植于兔眼表后，研究發(fā)現(xiàn)兩性霉素B脂質(zhì)體膠聯(lián)羊膜藥膜是一種較好的藥物緩釋系統(tǒng)。

2.5羊膜可與眾多生物材料共同構(gòu)建細胞/支架復合體 王馨[31]將人羊膜上皮細胞層和海綿層去除，將余下羊膜組織與自制的硝酸纖維素膜框架制成羊膜支架。研究發(fā)現(xiàn),所制作的羊膜支架貼合牢固，不會皺縮，可用于細胞的懸浮培養(yǎng)，還可以聯(lián)合皮膚表皮干細胞進行眼表的重建。齊愛青[32]通過構(gòu)建大鼠羊膜上皮細胞與膠原海綿復合體，將其移入大鼠視神經(jīng)損傷模型中，發(fā)現(xiàn)復合體能發(fā)揮大鼠羊膜上皮細胞與膠原海綿的協(xié)同作用，改善視神經(jīng)軸突再生的局部微環(huán)境，增加視網(wǎng)膜節(jié)細胞的存活量，促進視神經(jīng)軸突的再生。Chau等[33]將組織性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶與人羊膜進行交聯(lián)形成一種新的生物支架，體外研究發(fā)現(xiàn)，此種支架不僅能夠保持光學透明性，還能允許非免疫反應(yīng)的新生血管形成，為重建眼表結(jié)構(gòu)提供了新的治療方法。

3 小 結(jié)

羊膜以其復雜的組織學結(jié)構(gòu)，獨特的免疫學特性，在眼科領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。但目前羊膜的應(yīng)用仍存在諸多問題，羊膜中各種細胞因子在正常及異常眼各組織中如何發(fā)揮作用，如何促進創(chuàng)傷愈合，仍需進一步深入研究。相信隨著技術(shù)的完善與改進、對生物組織材料研究的進一步發(fā)展、對羊膜研究的進一步深入，各種適用于不同生物醫(yī)學領(lǐng)域的新型生物羊膜產(chǎn)品會研發(fā)出來。羊膜的應(yīng)用在眼科領(lǐng)域的發(fā)展會得到更加廣泛的體現(xiàn)。

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