王建沅周成旭嚴小軍駱其君蔣 瑩馬 斌譚應宏

(1. 寧波大學海洋學院, 寧波 315211; 2. 云南省麗江程海保爾生物開發(fā)有限公司, 麗江 674202)

雨生紅球藻在紅光下的生長及營養(yǎng)鹽消耗特征

王建沅1周成旭1嚴小軍1駱其君1蔣 瑩1馬 斌1譚應宏2

(1. 寧波大學海洋學院, 寧波 315211; 2. 云南省麗江程海保爾生物開發(fā)有限公司, 麗江 674202)

研究了在紅光下雨生紅球藻 Haematcoccus pluvialis的細胞增殖過程中, 葉綠素熒光參數(shù)的變化以及氮磷消耗特征, 并且研究了在不同初始氮磷濃度下, 細胞增殖周期、色素變化以及氮磷消耗速率, 以期為雨生紅球藻的培養(yǎng)工藝提供參考。結果顯示: (1)在細胞增殖過程中, 光合熒光參數(shù)ΦPSⅡ、qP、ETR與細胞增殖周期一致, 沒有顯著差異。Fv/Fm、NPQ則隨著細胞密度的上升而下降, 隨著細胞密度下降而上升, 且發(fā)生變化的拐點與營養(yǎng)鹽脅迫造成細胞數(shù)量下降的時間點基本一致。(2)以不同初始氮磷濃度(氮磷比 10︰1, 重量比)的培養(yǎng)液接種細胞, 較高濃度的氮磷條件(45/4.5—130/13.0 mg/L), 比較低濃度的氮磷條件(15/1.5—20/2.0 mg/L)有利于提高批次培養(yǎng)后的細胞終產量。但是, 在初始高濃度氮磷下, 接種初期細胞受到脅迫, 相對增長速率小; 氮磷消耗率低, 后期濃度維持高位; 藻細胞指數(shù)生長延遲, 培養(yǎng)周期變長。在紅光下, 最優(yōu)化的氮磷接種濃度為45/4.5 mg/L。研究結果對半連續(xù)培養(yǎng)雨生紅球藻的應用進行了討論。

雨生紅球藻; 細胞增殖; 氮磷營養(yǎng)鹽; 葉綠素熒光參數(shù); 紅光

雨生紅球藻Haematcoccus pluvialis能大量積累優(yōu)質蝦青素, 是一種高價值經濟微藻[1]。在培養(yǎng)時,采用綠色細胞培養(yǎng)和轉紅培養(yǎng)兩步法進行, 綠色細胞的高效培養(yǎng)是生產蝦青素的首要環(huán)節(jié)。先提高雨生紅球藻生物量、后進行誘導轉紅可獲得比一步培養(yǎng)更高產量的蝦青素[2]。雨生紅球藻累積蝦青素的過程,是細胞對各種環(huán)境脅迫非常靈敏的保護性反應。因此,優(yōu)化培養(yǎng)條件和工藝、避免綠色細胞在低生物量時進入抗脅迫代謝, 是綠色細胞培養(yǎng)研究的重點。

Tomohisa等[3]研究不同波長的 LEDs燈對雨生紅球藻的影響, 發(fā)現(xiàn)紅色 LEDs能促進綠色細胞生長, 而藍色LEDs能誘導高水平蝦青素的積累。齊安翔[4]發(fā)現(xiàn), 在低強度光照條件下, 紅、藍光比白光更能有效地促進綠色細胞的生長; 在誘導蝦青素積累時, 白光脅迫處理經不同波段光培養(yǎng)后的藻細胞,結果顯示, 紅光培養(yǎng)組藻粉產率最高, 藍光培養(yǎng)組蝦青素產率最高。Satoshi等[5]報道, 在低光強下, 長波光可避免綠色細胞在低生物量時發(fā)生形態(tài)變化而影響蝦青素終產量的提高。其他研究同樣顯示, 紅光對雨生紅球藻營養(yǎng)細胞的增殖具有促進作用[6,7]。我們的前期研究也顯示出這種促進作用, 紅光下氮磷營養(yǎng)鹽消耗快, 實驗組藻細胞更早地受到脅迫(待發(fā)表結果)。

目前關于紅光下雨生紅球藻的生長狀態(tài)、生理特征及營養(yǎng)鹽濃度需求等問題尚缺乏深入的研究,使該工藝的應用還處于基礎研究階段。本研究針對紅光下雨生紅球藻綠色細胞的培養(yǎng)過程, 分析了細胞增殖、氮磷營養(yǎng)鹽消耗、葉綠素熒光參數(shù)及三者之間的變化特征, 以期為雨生紅球藻規(guī)?；B(yǎng)殖的研究及培養(yǎng)工藝的改進提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 藻種

雨生紅球藻(NMBlud05-011)由寧波大學微藻種質庫提供。于NMB3#培養(yǎng)基中進行增殖預培養(yǎng), 培養(yǎng)基母液配方如表1所示, 使用時以1︰1000比例配制新鮮培養(yǎng)液。培養(yǎng)溫度 23 , ℃ 光強 20 μmol/ (m2·s) (D︰L=12h︰12h), 日光燈光源。

表1 NMB3#培養(yǎng)基母液配方Tab. 1 NMB3#medium stock solution

1.2 實驗方法

在紅光下, 一次培養(yǎng)中的細胞增殖、營養(yǎng)鹽消耗及葉綠素熒光參數(shù)變化 以紅色濾光膜過濾日光燈提供紅色給光條件。該濾光膜可完全透過＞550 nm的光, 濾除＜500 nm的光。

取預培養(yǎng)至平臺期的微藻(1.0×105cells/mL)接種于NMB3#培養(yǎng)液中(250 mL錐形瓶, 培養(yǎng)水體體積 200 mL), 3平行。置于溫度為 25 , ℃ 光照強度50 μmol/(m2·s) (D︰L=12h︰12h)的濾光培養(yǎng)室培養(yǎng)。每日搖瓶2—3次, 每天取樣檢測細胞密度, 跟蹤葉綠素熒光參數(shù)變化。隔天取藻液抽濾, 水樣凍存, 備檢氮磷營養(yǎng)鹽變化。

葉綠素光合熒光參數(shù)以Water-PAM葉綠素熒光儀檢測。

細胞密度以浮游植物計數(shù)框計數(shù)(北京普利特儀器公司)。

水樣的氮磷濃度以Smartchem全自動化學分析儀200分析。水樣低溫避光解凍后檢測。

在紅光下, 初始氮磷濃度對細胞增殖、營養(yǎng)鹽消耗、葉綠素熒光參數(shù)及色素的影響 取平臺期綠色細胞(1.1×105cells/mL), 基于 NMB3#培養(yǎng)基,設置接種時藻液氮、磷終濃度: 在相同的氮磷比(10︰1重量比)條件下, 藻液中的氮磷濃度由低到高: N/P=15/1.5 mg/L (Ⅰ)、N/P=20/2.0 mg/L (Ⅱ)、N/P=45/ 4.5 mg/L (Ⅲ)、N/P=85/8.5 mg/L ( )Ⅳ、N/P=130/13.0 mg/L (Ⅴ), 其他營養(yǎng)元素相同。培養(yǎng)水體體積200 mL, 各3平行。實驗組起始藻密度約為 5.3×104cells/mL。培養(yǎng)條件同上。

隔天取樣, 跟蹤生物量和氮磷濃度變化。

培養(yǎng)結束時, 收集全部微藻, 制備凍干藻粉,分析細胞色素。

細胞色素的測定: 參考Kwan和Kim[8]的方法, 測定凍干藻粉的葉綠素、胡蘿卜素和蝦青素的相對比值。

細胞增殖至平臺前期, 以酶標儀測定光密度表征相對生物量變化?？紤]培養(yǎng)后期的色素變化及細胞聚團可能造成的影響, 培養(yǎng)結束時, 以浮游植物計數(shù)框計數(shù)測定生物量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2003、SPSS 13.0和origin 7.5分析軟件進行分析和制圖。

100%, 其中A676(t1)和A676(t2)分別表示藻液在t1、t2時于676 nm處的光密度值。

2 結果

2.1 在紅光下一次培養(yǎng)中的細胞增殖、營養(yǎng)鹽消耗及葉綠素熒光參數(shù)變化

如圖 1所示, 平臺期接種后藻細胞迅速增殖,無滯緩期。氮磷營養(yǎng)鹽快速消耗, 與初始濃度(N/P=8.5/0.8 mg/L)相比, 在2d快速增殖后, 氮磷濃度分別下降 52.8%和 48.2%。氮磷營養(yǎng)鹽迅速降低導致細胞增殖停滯(4thd), 此時培養(yǎng)液中的氮磷濃度分別為2.81和0.27 mg/L。受氮磷營養(yǎng)鹽脅迫, 藻細胞逐漸由綠色游動細胞向紅棕色游動細胞轉變(8thd)。此后, 氮、磷濃度相對穩(wěn)定, 分別維持在2.0和0.2 mg/L左右。

圖1 紅光下雨生紅球藻的細胞增殖及培養(yǎng)液中氮磷變化Fig. 1 The growth of Haematcoccus pluvialis and the change of nitrogen (N) and phosphorus (P) concentration in the medium in a batch culture under red light

檢測增殖全程的葉綠素熒光參數(shù)(Fv/Fm、NPQ、ΦPSⅡ、qP、ETR)變化發(fā)現(xiàn)(圖2), ΦPSⅡ、ETR和qP與細胞增殖變化趨勢一致: 快速增殖時相應上升, 平臺期最大, 隨藻體因受營養(yǎng)鹽脅迫停止分裂衰亡時,又呈下降趨勢。而Fv/Fm和NPQ與藻細胞增殖過程呈現(xiàn)互逆現(xiàn)象, 在細胞快速增殖時均呈下降趨勢, 從平臺期向衰敗期轉化過程中又逐漸上升, 中間出現(xiàn)明顯的拐點, 此時培養(yǎng)液中的N、P濃度為2.81和0.27 mg/L。

圖2 紅光下雨生紅球藻一次培養(yǎng)過程中的葉綠素熒光參數(shù)變化Fig. 2 The change of chlorophyll fluorescence parameters of Haematcoccus pluvialis in batch culture under red light

2.2 在紅光下, 初始氮磷濃度對細胞增殖、營養(yǎng)鹽消耗、葉綠素熒光參數(shù)及色素的影響

細胞增殖 在相同初始接種密度下, 不同濃度的氮磷影響藻細胞的增殖狀態(tài), 使培養(yǎng)過程出現(xiàn)差異。圖3顯示, 5個實驗組的藻細胞生長狀態(tài)大致可分成三組, 低氮磷濃度的Ⅰ、Ⅱ組, 以及較高濃度的(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)組。Ⅰ組和Ⅱ組接種后即快速增殖, 8d到達平臺期, 前 4d的倍增速率明顯大于后 4d (圖4)。較高濃度的Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ三組, 初期遲滯期相對于Ⅰ、Ⅱ組延長, 而Ⅲ組的初期增長速率大于Ⅳ和Ⅴ組。前 4天隨濃度的升高, 細胞倍增速率下降; 6d后進入快速增殖期, 細胞的增殖速率明顯增大(圖4)。 三個較高氮磷接種濃度的實驗組能夠達到相對于Ⅰ、Ⅱ組更高的生物量, 但三組的最大生物量之間沒有顯著差異(P＞0.05)(圖5)。

圖3 不同初始氮磷濃度下雨生紅球藻的細胞增殖Fig. 3 The growth of Haematcoccus pluvialis under different initial concentration of nitrogen (N) and phosphorus (P)

氮磷營養(yǎng)鹽變化 如圖 6所示, 細胞增殖過程與氮磷消耗密切相關。較低氮磷濃度Ⅰ、Ⅱ兩組中, 初期細胞增殖迅速, 氮磷營養(yǎng)鹽消耗率高;后期生長受脅迫, 氮磷消耗變緩。Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ組的細胞初期增殖受到抑制, 營養(yǎng)鹽消耗率低, 尤其是第Ⅴ組, 0—4d氮、磷的消耗顯著滯緩, 僅為初始濃度的3.7%和4.2%, 遠低于其余各組, Ⅲ組細胞的氮磷消耗高于Ⅳ和Ⅴ組。培養(yǎng)結束時, Ⅳ、Ⅴ兩組的氮磷濃度仍維持在較高水平, 分別為42.54/5.37 mg/L和98.39/8.44 mg/L, 藻液外觀呈綠色, 而其余各組均不同程度地轉變成紅色。

圖4 不同氮磷濃度組中雨生紅球藻倍增速率的變化Fig. 4 The multiplication rate of Haematcoccus pluvialis under different concentration of nitrogen (N) and phosphorus (P)

圖5 不同氮磷起始濃度下雨生紅球藻達到的最大生物量Fig. 5 The maximum biomass of Haematcoccus pluvialis under different initial concentration of nitrogen (N) and phosphorus (P)

進一步分析氮磷消耗量比值發(fā)現(xiàn)(圖 7, 氮磷消耗量比值是相對于前一時間點氮磷濃度減少量的比值: N(Tt-1–Tt)/P(Tt-1–Tt)), 氮磷消耗量比值在各實驗組的細胞分裂增殖過程中均呈下降趨勢。Ⅰ-Ⅳ組的特征顯示, 隨著氮磷起始濃度增高, 其下降的斜率增大。最高濃度Ⅴ組的氮磷消耗量比值變化特征與其余四組相異, 前6天呈上升趨勢, 之后下降。前6天處于細胞增殖受抑的滯緩期, 第 6天后細胞快速增殖, 此時氮磷消耗量比值下降。

細胞色素 在培養(yǎng)結束時, 對細胞色素的分析結果顯示(圖 8),Ⅰ、Ⅱ兩組已處于營養(yǎng)鹽顯著脅迫狀態(tài), 胡蘿卜素的相對含量高, 蝦青素明顯增加,藻液外觀呈紅色。Ⅲ組受到的脅迫程度低于Ⅰ、Ⅱ兩組, 藻液外觀呈紅棕色。Ⅳ-Ⅴ組的營養(yǎng)鹽脅迫程度低(培養(yǎng)液中殘余的氮磷濃度仍較高), 胡蘿卜素和蝦青素的相對含量低。Ⅳ和Ⅴ兩實驗組的細胞色素含量沒有顯著差異(P＞0.05), 藻液外觀仍呈綠色。

圖7 不同氮磷接種濃度下, 培養(yǎng)過程中的氮磷元素消耗量比值變化趨勢Fig. 7 The variation of the ratio of absorbed nitrogen and phosphorus in medium during the cultivation of different initial concentration of nitrogen and phosphorus

3 討論

光照條件和營養(yǎng)鹽濃度是影響雨生紅球藻增殖和蝦青素積累的關鍵因素。已有多次報道長波長的光有利于綠色細胞的增殖, 并且影響轉紅培養(yǎng)后的蝦青素產量[4,5]。因此, 研究紅光下的藻生理特征變化是優(yōu)化生產工藝的基礎。

葉綠素熒光分析技術具有快速、靈敏、對細胞無損傷等優(yōu)點, 實時反映環(huán)境脅迫對光合生理產生的影響, 已廣泛應用于微藻的脅迫生理研究[9]。Dewez等[10]討論了將葉綠素熒光參數(shù)變化作為藻類受脅迫“biomarker”的可行性。本研究發(fā)現(xiàn), 紅光下雨生紅球藻的Fv/Fm和NPQ在綠色細胞培養(yǎng)過程中呈先降后升的趨勢, 與細胞增殖周期及營養(yǎng)鹽消耗有顯著相關性, 并出現(xiàn)明顯的拐點, 從而指示藻細胞的培養(yǎng)狀態(tài)。NPQ是由于光合膜兩側的質子梯度和形成的膜高能態(tài)引起的, 與ATP的形成和光合膜的狀態(tài)有關。在紅球藻細胞增殖至平臺期時, NPQ下降說明紅球藻的卡爾文循環(huán)活躍, 能量利用率高;隨著藻細胞逐漸受脅迫作用, NPQ變大, 表明紅球藻的卡爾文循環(huán)受抑制程度逐漸加大, PSⅡ的潛在熱耗散能力增強, 從而起到保護光合器官的作用,是紅球藻響應外界環(huán)境脅迫的一種生理機制[11]。Fv/Fm后期上升可能是此時的營養(yǎng)脅迫已引起細胞累積部分蝦青素與胡蘿卜素, 葉綠素的相對含量減少, 而初始熒光Fo的大小與葉綠素濃度有關, 葉綠素的減少導致Fo變小, Fv變大(Fv=Fm–Fo), 使Fv/Fm變大[12,13]。因此, 有可能利用葉綠素熒光參數(shù)的變化來指示雨生紅球藻培養(yǎng)過程中發(fā)生的營養(yǎng)鹽脅迫, 為半連續(xù)培養(yǎng)中營養(yǎng)鹽的更新時機提供參考。在深入的研究中, 還需要分析葉綠素熒光參數(shù)的拐點指示在怎樣的培養(yǎng)條件中成立、細胞各光合色素的定量變化是否與葉綠素熒光參數(shù)指示的結果具有實時一致性等問題。

圖8 不同氮、磷起始濃度下培養(yǎng)的雨生紅球藻的色素含量相對比值

氮磷濃度和比值是影響微藻營養(yǎng)生長的重要因素, 且同時影響代謝產物的含量和組成。氮磷濃度過低不能滿足微藻的營養(yǎng)生長從而影響生物量的提高, 并可造成藻細胞低密度時即受脅迫過早紅化[14];氮磷濃度過高同樣會對雨生紅球藻的細胞增殖產生抑制作用, 對生產的連續(xù)性帶來不確定因素, 且不利于第二步轉紅培養(yǎng)的進行[15]。García-Malea等[16]研究發(fā)現(xiàn), 當NO3–-N濃度超過28 mg/L時, 隨氮濃度的升高平臺期的最大生物量變化不大, 當濃度超過60 mg/L時, 無論光照強度如何改變, 大部分藻細胞群體將以綠色細胞狀態(tài)存在而不積累蝦青素。Borowitzka等[17]曾報道, 雨生紅球藻在KNO3濃度為0.01 g/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)10d即能完全轉化成紅色胞囊, 但在KNO3濃度為0.1 g/L培養(yǎng)時, 一個月后僅生成小部分紅色胞囊。在本研究中, 雨生紅球藻在紅光下培養(yǎng), 當KNO3濃度為 0.07—0.15 g/L時,藻細胞一周左右完全轉紅; 當濃度為 0.32 g/L時,藻細胞培養(yǎng)至 12d轉為紅棕色; 而當濃度大于0.61 g/L時, 很少有藻細胞轉為紅色胞囊。造成各研究結果的絕對濃度有差異的主要原因在于培養(yǎng)條件的不同。因此在實際生產中, 相對不同藻株以及不同工藝能力, 需要有針對性的綜合參數(shù)指標。但所有結果顯示相同的特征: 在適宜低的氮磷添加濃度下, 營養(yǎng)鹽消耗迅速, 接種后增殖速率高, 縮短紅球藻達到最大生物量的生長周期; 較高濃度的氮磷則相對延長藻細胞的生長周期, 而高濃度的氮磷會抑制藻細胞的增殖和轉紅。

半連續(xù)培養(yǎng)在一定程度上能夠克服批次培養(yǎng)的不利因素。但營養(yǎng)鹽的添加劑量及添加時機是優(yōu)化半連續(xù)工藝的關鍵因素, 本研究的結果顯示, 在培養(yǎng)過程中跟蹤檢測葉綠素熒光參數(shù)Fv/Fm和NPQ的變化, 可能指示雨生紅球藻綠色細胞培養(yǎng)階段的營養(yǎng)鹽變化脅迫; 當營養(yǎng)鹽脅迫發(fā)生時, 藻類進入平臺期, 適宜濃度的營養(yǎng)鹽添加劑量則是優(yōu)化生長過程的關鍵。本研究顯示, 在紅光下培養(yǎng)時, 當藻細胞起始密度約為 5×104(cells/mL)時, 初始氮磷濃度為45/4.5 mg/L 左右最優(yōu)。在兩步法培養(yǎng)雨生紅球藻生產蝦青素的工藝中, 紅色光照有利于綠色細胞的培養(yǎng), 進一步研究尚需要就光強及光暗比等條件的影響進行深入研究。

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THE CHARACTERISTICS OF GROWTH AND NUTRIENT CONSUMPTION OF HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS UNDER RED LIGHT

WANG Jian-Yuan1, ZHOU Cheng-Xu1, YAN Xiao-Jun1, LUO Qi-Jun1, JIANG Ying1, MA Bin1and TAN Ying-Hong2
(1. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China; 2. Chenghai Bao’er Biotechnology Inc., Lijiang 674202, China)

It has been proposed that Haematococcus pluvialis grow better under red light than PAR. In the present study, the characteristics of chlorophyll fluorescence parameters and nutrient requirements during population growth under red light were analyzed. The results showed that chlorophyll fluorescence parameters ΦPS II, qP and ETR had the same variation trend along with the population growth phase. Fv/Fmand NPQ decreased with the increased cell numbers, and then increased at the late growth stage when the cell density decreased. The turning point of Fv/Fmand NPQ is practically consistent with the cell stress condition caused by nutrient depletion stress. High concentrations of the nutrients nitrogen (N) and phosphorus (P) such as 85/8.5 mg/L and 130/13.0 mg/L enhanced the biomas at early stage, and then inhibited cell growth at the longer retarded phase before entering exponential growth phase that Nutrient consumption was also reduced. These results suggested that the optimum of N/P concentration for H. pluvialis cultured under red light was 45/4.5 mg/L. The potential application of the results in semi-continuous culture of H. pluvialis has been discussed.

Haematococcus pluvialis; Cell growth; Nitrogen and phosphorus; Chlorophyll fluorescence parameters; Red light

Q178.1+1

A

1000-3207(2014)06-1135-08

10.7541/2014.165

2013-11-08;

2014-05-22

教育部博士點優(yōu)先發(fā)展領域課題(20133305130001); 浙江省重大科技創(chuàng)新團隊“海洋生物技術產業(yè)科技創(chuàng)新團隊”2011R10029; 浙江省重點基金(Z3100565)資助

王建沅(1990—), 女, 浙江上虞人; 碩士; 主要從事微藻生物技術研究。E-mail: 731726876@qq.com

嚴小軍, E-mail: yanxiaojun@nbu.edu.cn