徐 敏 張海軍 鄧道貴 王文平 張曉莉 查嶺生

(淮北師范大學生命科學學院, 資源植物生物學安徽省重點實驗室, 淮北 235000)

基于16S rDNA和COⅠ基因序列探討四種溞類的系統(tǒng)關系和分類地位

徐 敏 張海軍 鄧道貴 王文平 張曉莉 查嶺生

(淮北師范大學生命科學學院, 資源植物生物學安徽省重點實驗室, 淮北 235000)

為了檢驗已記錄的4 個 溞屬種類(隆 線 溞Daphnia carinata 、透明 溞D. hyalina 、蚤狀 溞D. pulex和大型 溞D. magna)的系統(tǒng)分類, 用試劑盒法分別提取4 種 溞類的基因組DNA。利用特異性引物, 通過PCR擴增了4 種 溞屬種類的16S rDNA和COⅠ基因部分序列, 并與來自GenBank中每個種類相似度較高的同種序列進行分析。結果表明, 基于16S rDNA和COⅠ基因, 4 個 溞屬種類的平均種間相似度分別為85.56%和80.67%,堿基中A+T含量均明顯高于G+C含量?；贑OⅠ基因, 巢湖隆線 溞與來自GenBank 上的擬同形 溞(Daphnia similoides AB549199)相似度為99%, 分歧度為0.4%—0.9%。就16S rDNA和COⅠ基因而言, 巢湖透明 溞更接近于盔形 溞(Daphnia galeata)?；?6S rDNA和COⅠ基因構建的NJ樹和貝葉斯樹, 兩者的主要分枝基本一致。結果暗示, 巢湖隆線 溞 與擬同形 溞為一個種, 透明 溞 應屬于盔形 溞。由于缺乏核基因的研究, 有關巢湖 溞屬的分類地位還需進行更深入的探討。

溞屬; 16S rRNA; COⅠ基因; 系統(tǒng)分類

溞屬隸屬節(jié)肢動物, 又稱水蚤或 溞, 是枝角類中重要的類群。本屬描述的種類超過 100種, 但僅有三十余種被準確地鑒定, 我國現存的 溞屬種類有10余種[1,2]。 早期的 溞類分類研究主要依據其形態(tài)學特征。由于 溞屬動物有十分豐富的變異類型, 屬內近源種之間可以雜交, 因此 溞屬種類可能存在種間雜種。例如, 盔型 溞(Daphnia galeata)、 僧帽 溞(D. cucullata)、 透明 溞(D. hyalina)、 玫瑰 溞(D. rosea)、長刺 溞(D. longispina)都 屬于盔型 溞的種復合體, 可以形成種間雜交種[3,4]。而近年來我國在枝角類的分類方面研究尚不多見, 在 溞屬種類的分類鑒定中存在界定模糊, 甚至出現鑒定錯誤的現象[2,5]。我國的《中國動物志·淡 水枝角類》中把同形 溞 歸到隆線溞一類, 沒有關于擬同形 溞的記載。此外, 只介紹了透明 溞的幾種變異類型, 也沒有對盔形 溞進行描述。據報道, 我國一些水體中的同形 溞可能一直被命名為隆線 溞或者鸚鵡 溞[5]。

隨著分子生物學的發(fā)展, 分子標記被逐漸應用到物種的系統(tǒng)進化研究中。Schwenk等用線粒體16S rRNA基因對部分枝角類種類進行分子系統(tǒng)進化分析, 建立了比較直觀的系統(tǒng)進化樹[6]; Gelas和Meester用線粒體COⅠ 基因分析了歐洲大型 溞的不同的單倍型[7]; Briski等采用線粒體COⅠ基因和16S rRNA基因的分子標記方法, 利用船舶壓載水所攜帶的休眠卵識別外來入侵的無脊椎動物[8]。近幾年來, 我國學者在象鼻 溞屬(Bosmina)[9]、盔形 溞(D. galeata)[10]、 秀體 溞屬(Diaphanosoma)[11]、 薄皮 溞屬(Leptodora)[12]、 圓形盤腸 溞(Chydorus sphaericus)[13]等枝角類的遺傳多樣性方面做了一些工作, 但對國內 溞類種間系統(tǒng)分化的研究尚未見報道。本研究通過對安徽已發(fā)現的大型 溞、隆線 溞、透明 溞、蚤狀溞等四種 溞屬種類的16S rDNA和COⅠ基因序列進行分析, 探討這些 溞屬種類的歸屬以及他們之間的分子系統(tǒng)關系, 初步解決一些傳統(tǒng)分類上存在爭議的分類問題, 以期為國內 溞屬的分子系統(tǒng)學研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

研究用大型 溞于2007年3月用25號浮游生物網在淮河采集; 蚤狀 溞 、隆線 溞 、透明 溞由2012年3月采集的巢湖沉積物中的休眠卵孵化而來, 并分離鑒定[2,14](表1)。 幾種 溞類均在智能光照培養(yǎng)箱中用斜生柵藻培養(yǎng), 2—3d更換一次培養(yǎng)液, 溫度為20 ℃ ±1℃、光照時間L︰D=12h︰12h。實驗時用吸管吸取單只個體饑餓一晝夜后用雙蒸水沖洗, 離心管收集備用。

1.2 基因組DNA提取

本實驗采用微量樣品基因組 DNA試劑盒(TIANamp Micro DNA Kit)提 取 溞屬DNA 。由于溞屬種類屬于小型甲殼動物, 外被甲殼, 在提取前用滅菌的牙簽搗碎 溞體, 有利于蛋白酶K對組織進行消化。

1.3 PCR擴增及序列測定

用于擴增COⅠ基因引物:

COIF (5′-AYCAATCATAAGGACYATTGGRAC-3′)

COIR (5′-KGTGATWCCNACHGCTCAKAC-3′)

用于擴增16S rDNA基因引物[15]:

L2510(5′-CGCCTGTTTAACAAAAACAT-3′)

H3059(5′-CCGGTCTGAACTCAGATCATGT-3′)

PCR反應體系25 μL, 每個反應體系內含PCR Buffer 2.5 μL、dNTP 4.0 μL、Mg2+0.5 μL、模板DNA 1.0 μL、Taq酶0.25 μL、上下游引物各1.0 μL, 雙蒸水補足到25 μL。

擴增條件為 95℃預變性 3min, 95℃變性 45s, 50℃退火 45s, 72℃延伸 45s, 共 35個循環(huán), 72℃10min充分延伸, 4℃結束。

表1 本研究中樣本的核苷酸序列的來源及編號Tab. 1 The origin and number of nucleotide sequence of samples in this study

擴增產物經電泳檢測后, 選擇目的帶清晰且明亮的 PCR反應產物送交生工公司純化, 并測序。其中16S rDNA采用雙向測序, 正反向對比后確定分析用序列, 用DNASTAR中的seqnam比對后獲得隆線溞539個堿基, 對比峰圖修除兩端不可靠的堿基, 經人工校正后5 溞個隆線 個體共獲得有效堿基為510-19個(C1S510、C2S517、C3S517、C4S515、C5S519)。同樣地, 溞蚤狀 的有效堿基為 479-22個(P1S479、P2S522), 溞透明 為482-20個堿基(H1S513、H2S520、H3S520、H4S482、H5S520、H6S520), 大溞型 為519個有效堿基。來自5個休眠卵孵化的隆線溞的16S rDNA序列完全相同, 來自6個休眠卵孵化溞的透明 的16S rDNA序列也完全相同, 溞蚤狀 的兩個序列存在多態(tài)性, 分別用P1、P2構建進化樹。在序列對比中, 溞除大型 只有1個個體外, 溞每種 取片段最長的個體進行比對, 分別用C5S、H2S、M1S、P1S、P2S進行分析(表1)。COⅠ基因采用單向測序,獲得5個種類16個個體長度為499個堿基的COⅠ部分序列, 其中7 溞個隆線 個體中有4個單倍型, 透溞明 6個個體的COⅠ序列完全一致, 溞蚤狀 2個個體有2個單倍型。由于物種內存在多態(tài)性, 溞隆線 、溞溞溞透明 、蚤狀 、大型 分別取C1I、C2I、C5I、C7I、H1I、P1I、P2I和M1I參與比對(表 1)。通過NCBI中BLAST比對, 分別找出與本研究相似度最高的序列放在文中一起分析。參考已測出Daphnia pulex全序列[16](GenBank登錄號AF117817)中16S rRNA基因定位剪出AF117817的16S rRNA基因進行比對, 其他用于分析的下載序列見表1。

1.4 系統(tǒng)發(fā)生分析

用DNASTAR對測序結果進行人工校正, 并去除兩端冗余序列。使用BioEdit建立序列相似矩陣圖,用Clustalx1.81軟件多重序列比對, 用DNAspV5分析變異位點, 用Mega4.1計算不同序列間轉換/顛換數、生成序列差異位點表、并計算遺傳距離和構建NJ進化樹。采用K2P雙參模型計算兩兩遺傳距離,系統(tǒng)樹設置采用 P-distance模型, 兩種分子標記分溞別以脆弱象鼻 和Bosmina cf. liederi為外群, Bootstrap Replications1000次; 用 Mrbayes3.2構建貝葉斯樹, 替換模型設置參數nst=6 (GTR模型), 位點速率變異設置 invgamma, 其余設置為默認值; 采用mcmc法運算1000000代, 每100代取樣一次, 在舍棄25%老化樣本后, 用剩余樣本構建一致樹。

2 結果

2.1 基于16S rDNA的結果分析

C5S、H2S、M1S、P2S在DNASTAR中經過兩兩序列比對, 平均種間相似度為 85.56%, 堿基中A+T(66.2%)含量明顯高于G+C(33.8%)含量。與來自GenBank上Daphnia的16S rDNA進行序列比對, 并計算遺傳距離(表2); 用DNAspV5進行序列變異位點分析, 表2中12 溞個 個體可識別位點(包括缺失與丟失的位點)445個, 其中保守位點 326個, 變異位點119個, 單一位點18個, 簡約信息點101個; 用MEGA軟件分析平均轉換/顛換(si/sv)數為 1.25, 轉換數明顯高于顛換數。就構建的NJ樹(圖1)和貝葉斯樹來看, 兩者主要分枝基本一致。

表2 12個溞類個體16S rDNA的遺傳距離(對角線下)和序列相似度(對角線上)Tab. 2 The genetic distances (below diagonal) and sequence similarity (above diagonal) of 16S rDNA in twelve Daphnia individuals

圖1 基于12 溞個 屬個體16S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)生樹(NJ樹)Fig. 1 NJ tree based on the sequence of 16S rDNA in twelve Daphnia individuals

2.2 基于COⅠ基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究發(fā)現4個種類16個個體的COⅠ基因部分序列中, 隆線 溞7個個體中, 有4個單倍型, 平均相似率為 99%, 有三個多態(tài)性位點均發(fā)生轉換。蚤狀 溞2個個體序列相似度為98%(表3)。參與分析的4個種類8個個體中平均種間相似率為80.67%, 低于16S rDNA的種間相似度。A+T含量(69.25%)明顯高于 G+C(30.75)含量, 符合無脊椎動物 A、T含量高的特點。用 DNAspV5分析可識別的位點數為569個, 其中保守性位點 368個, 變異位點 201個,遠大于16S rDNA的變異。單一位點15個, 簡約信息點186個(圖2)。用Mega 4.1軟件分析堿基的轉換/顛換樹之比為1.42。就構建的NJ樹(圖2)和貝葉斯樹來看, 兩者主要分枝也基本一致。

圖2 基于17 溞個 屬個體線粒體COI基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)生樹(NJ樹)Fig. 2 NJ tree based on the sequence of mitochondrial COI gene in seventeen Daphnia individuals

表3 17個溞類個體基于線粒體COI基因的遺傳距離(對角線下)及序列相似度(對角線上)Tab. 3 The genetic distances (below diagonal) and sequence similarity (above diagonal) based on mitochondrial COI gene in seventeen Daphnia individuals

3 討論

3.1 有關幾種爭議溞類的命名和分類地位的探討

鸚鵡 溞和隆線 溞由于在形態(tài)上十分接近, 國內學者在參考中國動物志進行鑒定時有可能把兩者混為一談, 統(tǒng)稱為隆線 溞[5,6]。近幾年來, 關于同形溞的報道逐漸增多, 以前以隆線 溞命名的種名逐漸更正為同形 溞[5]。 隆線 溞最早由King在1853年進行繪圖描述, 我國的中國動物志中也參考了King的形態(tài)描述, 記載了我國隆線 溞的分布。通過形態(tài)比對,國內學者早年描述的隆線 溞在形態(tài)上與 King的記載存在很大的區(qū)別[17]。在本研究中, 選用的 7個個體16S rRNA基因均相同而COⅠ基因有所不同, 這驗證了16S rRNA基因相對保守、COⅠ基因變異較大的特點?；?6S rDNA序列可以看出, 與C5S相似度最大的為同形 溞(Daphnia similis), 相似度為94%?；贙2P模型分歧度為4.9%(表2), 接近5%的枝角類線粒體的種內分歧度[18]。同時, 基于COⅠ基因序列, 與C1I-C7I 相似度最大均為擬同形溞(Daphnia similoides)?；?K2P模型分歧度為0.4%—0.9% (表3), 明顯小于枝角類種內差異5%的數值。因此, 僅僅從線粒體序列差異來看, 巢湖隆線溞應為擬同形 溞, 兩種不同標記的進化樹均支持以上結論(圖1、圖2)。這與顧楊亮等[17]結合形態(tài)分類的研究結果一致。

關于透明 溞和盔形 溞的歸屬也存在問題, 國內學者分類一般參考《中國動物志·淡水枝角類》[2]均以透明 溞命名。近年來, 國內學者將透明 溞的命名逐漸更正為盔形 溞[19]。在本研究中, 巢湖透明 溞與盔形 溞基于16S rDNA的相似度為98%, 基于K2P模型的遺傳距離為0.7% (表2); 同時基于COⅠ基因相似度為97%—98%, 基于K2P模型的遺傳距離為1.8%—2.3% (表3); 兩種分子標記均支持透明 溞為盔形 溞的結論。本實驗所構建的兩種進化樹也均顯示巢湖透明 溞與盔形 溞的親緣關系最近(圖1、圖2)。據報道, 透明 溞 、盔形 溞 、僧帽 溞 、長刺 溞等近源物種之間存在種間雜交的現象, 其雜交種具有外形相近、核基因相同線粒體基因相近或線粒體基因相同核基因相近的特點[6,20]。僅根據線粒體基因來劃分, 巢湖的透明 溞 應與盔形 溞為同一個物種。在本研究中, 來自GenBank的D. mendotae在國內尚未見記載, 且與巢湖透明 溞和來自GenBank 的盔形溞遺傳距離在種內范圍內, 該種也可能為盔形 溞的種復合體。在今后的研究中將增加分子標記的數量,以及增加核基因與線粒體基因進行對比, 以確定巢湖 溞屬種類間是否存在種復合體。

3.2 四種溞類的系統(tǒng)進化關系分析

據報道, 16S rDNA進化速度較慢且相對保守[21],而COⅠ基因變異相對較大, 約是16S rDNA的1.5倍[22]。在本研究中, 12 個 溞個體16S rDNA變異率(總變異數/可識別位點數)為 26.7%, COⅠ基因的變異率為35.3%, 是16S rDNA變異率的1.32倍。兩種測序結果的A+T含量均明顯高于G+C的含量, 這一結果與其他學者在無脊椎動物中研究結果相一致[23—25]。基于 COⅠ基因的 K2P雙參模型遺傳距離, 屬內種間距離最小為 8.7%, 最大為 29.9%, 與端足類鉤蝦屬的種間距離一致(min 5.58—max 31.39)[26]。通過序列比對可以看出, 四種 溞類的 16S rRNA基因變異區(qū)較集中, 而COⅠ基因變異區(qū)較分散。兩種分子標記構建的進化樹均顯示, 大型 溞 與擬同形 溞親緣關系最近, 這也符合形態(tài)分類標準, 他們同為一個亞屬。大型 溞與擬同型 溞先聚為一支, 然后與盔形溞聚為一支, 最后與蚤狀 溞聚在一起; 根據進化樹物種分枝時間不同, 四種 溞的進化趨勢由低到高為蚤狀 溞— 盔形 溞— 大型 溞— 擬同形 溞。在本研究中,基于16S rDNA, 與P1S、P2S相似度最大和遺傳距離最小的均為短鈍 溞(D. obtusa), 其次才為蚤狀 溞;而在COⅠ基因的比對中與P1S、P2S相似度較高的均為蚤狀 溞; 在構建的系統(tǒng)樹中, 基于16S rDNA的進化樹出現了巢湖蚤狀 溞最先與短鈍 溞并為一支,而在基于COⅠ的進化樹中卻沒有出現這種現象。另外, 基于16S rDNA, 巢湖蚤狀 溞與來自GenBank的蚤狀 溞種內遺傳距離(0.81—0.86)大 于其他 溞種內遺傳距離, 巢湖蚤狀 溞與來自GenBank 上的短鈍溞間的分類關系有待于進一步研究。線粒體為非編碼蛋白質基因, 進化過程中沒有受到密碼子選擇壓力影響, 其大部分區(qū)域發(fā)生的變異為中性突變[27], Schubart等提出的16S rDNA分子鐘理論, 即每百萬年序列變異為0.4%—0.9%[28]。P1S、P2S均來自巢湖休眠卵的孵化, 其基因序列差異為1%, 可以推測2個蚤狀 溞個體的分化時間約為1.11百萬—2.5百萬年前, 這在其他幾個個體中均沒有出現過。由此可見, 巢湖 溞屬種類的遺傳多樣性和種類的系統(tǒng)進化關系還需進一步探討。

參考文獻：

[1] Zhao W. Hydrobiology [M]. Beijing: China Agricultural University Press. 2005, 181 [趙文. 水生生物學. 北京: 中國農業(yè)大學出版社. 2005, 181]

[2] Jiang X Z, Du N S. Fauna Sinica: Crustacean, Freshwater Cladocera [M]. Beijing: Science Press. 1979, 102—118 [蔣燮治, 堵南山. 中國動物志·淡水枝角類. 北京: 科學出版社. 1979, 102—118]

[3] Wolf H G, Mort M A. Inter-specific hybridization underlies phenotypic variability in Daphnia populations [J]. Oecologia, 1986, 68: 507—511

[4] Hebert P D N, Schwartz S S, Hrbacek J. Pattern of genotypic diversity in Czechoslovakian Daphnia [J]. Heredity, 1989, 62: 207—216

[5] Benzie J A H. The Genus Daphnia (Including Daphniopsis) [M]. In: Dumont H J F (Eds.), Guides to the Identification of the Microinvertebrates of the Continental Waters of the World. Leiden: Backhuys Publishers. 2005, 305—310

[6] Schwenk K, Sand A, Boersma M, et al. Genetic markers, genealogies and biogeographic patterns in cladocera [J]. Aquatic Ecology, 1998, 32: 37—51

[7] Gelas K D E, Meester L D E. Phylogeograph of Daphnia magna in Europe [J]. Molecular Ecology, 2005, 14: 753—764

[8] Briski E, Cristescu M E, Bailey S A, et al. Use of DNA barcoding to detect invertebrate invasive species from dispausing eggs [J]. Biology Invasions, 2011, 13: 1325—1340

[9] Fan F J. Morphology and molecular phylogeny of Bosmina in China [D]. Thesis for Master of Science, Jinan University, Guangzhou. 2010 [范風娟. 溞中國象鼻 屬的形態(tài)與分子系統(tǒng)發(fā)育學研究. 碩士學位論文, 暨南大學, 廣州. 2010]

[10] Ren J J. Analysis of random amplified polymorphic DNA of genetic diversity of four geographic populations of Daphnia galeata [D]. Thesis for Master of Science, Jinan University, Guangzhou. 2010 [任晶晶. 4 溞個盔型 地理種群遺傳多樣性的RAPD分析. 碩士學位論文, 暨南大學,廣州. 2010]

[11] Chen H. The morphology and molecular phylogeny of Diaphanosoma in China [D]. Thesis for Master of Science, Jinan University, Guangzhou. 2011 [陳花. 溞中國秀體 屬的形態(tài)與分子系統(tǒng)發(fā)育學研究. 碩士學位論文, 暨南大學,廣州. 2011]

[12] Xu L, Han B P, Damme K V, et al. Biogeograph and evolution of the Holarctic zooplankton genus Leptodora (Crustacea: Branchiopoda: Haplopoda) [J]. Journal of Biogeography, 2011, 38: 359—370

[13] Hu H J, Yan Q Y, Ni J J, et al. Genetic structures of Chydorus sphaericus populations from lake Donghu, Wuhan [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2013, 37(6): 1007—1012 [胡紅娟, 顏慶云, 倪加加, 等. 溞武漢東湖圓形盤腸 種群遺傳結構分析. 水生生物學報, 2013, 37(6): 1007—1012]

[14] Deng D G, Xie P, Zhou Q, et al. Field and experimental studies on the combined impacts of cyanobacterial blooms and small algae on crustacean zooplankton in a large, eutrophic subtropical Chinese lake [J]. Limnology, 2008, 9: 1—11

[15] Bouchon D, Souty-Grosset C, Raimond R. Mitochondrial DNA variation and markers of species identity in two penaeid shrimp species: Penaeus monodon Fabricius and P. japonicus Bate [J]. Aquaculture, 1994, 127(2): 131—144

[16] Crease T J. The complete sequence of the mitochondrial genome of Daphnia pulex (Cladocera: Crustacea) [J]. Gene, 1999, 233(1—2): 89—99

[17] Gu Y L, Xu L, Lin Q Q, et al. A new subspecies of Daphnia: Daphnia similoides sinensis [J]. Ecological Science, 2013, 32(3): 308—312 [顧楊亮, 徐磊, 林秋奇, 等. 新亞種—中

溞華擬同形 (Daphnia similoides sinensis). 生態(tài)科學, 2013, 32(3): 308—312]

[18] Adamowicz S J, Petrusek A, Colbourne J K, et al. The scale of divergence: a phylogenetic appraisal of intercontinental allopatric speciation in a passively dispersed freshwater zooplankton genus [J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2009, 50(3): 423—436

[19] Deng C. Effects of nutrient enrichment and fish stocking on zooplankton communities [D]. Thesis for Master of Science, Jinan University, Guangzhou. 2011 [鄧琛. 營養(yǎng)鹽加富和魚類補充對浮游動物群落的影響. 碩士學位論文, 暨南大學,廣州. 2011]

[20] Dlouhá S, Thielsch A, Kraus R, et al. Identify hybridizing taxa within the Daphnia longispina species complex:a comparison of genetic methods and phenotypic approaches [J]. Hydrobiologia, 2010, 634: 107—122

[21] Dai Y J, Liu P, Gao B Q, et al. Sequence analysis of mitochondrial 16S rRNA and COiv gene fragments of four wild populations of Portunus trituberculatus [J]. Periodical of Ocean University of China, 2010, 40(3): 54—60 [戴艷菊,劉萍, 高保全, 等. 三疣梭子蟹 4個野生群體線粒體16SrRNA和COiv基因片段的比較分析. 中國海洋大學學報, 2010, 40(3): 54—60]

[22] Taylor D J, Finston T L, Hebert P D N. Biogeography of a widespread freshwater crustacean: Pseudocongruence and cryptic endemism in the North American Daphnia leavis complex [J]. Evolution, 1998, 52: 1648—1670

[23] Anderson F E. Phylogeny and historical biogeography of the loliginid squids (Mollusca: Cephalopoda) based on mitochondrial DNA sequence data [J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2000, 15(2): 191—214

[24] Gao T X, Zhang X M, Yoshizaki G, et al. Study on mitochondrial DNA sequences of Japanese mitten crab, Eriocheir Japonica I. 12S rRNA [J]. Journal of Ocean University of Qingdao, 2000, 30(1): 43—47 [高天翔, 張秀梅, 吉崎悟朗, 等. 日本絨螯蟹線粒 DNA序列研究 I.12SrRNA. 青島海洋大學學報, 2000, 30(1): 43—47]

[25] Liu J, Li Q, Kong L F, et al. COⅠ-based DNA barcoding in mytilidae species (Mollusca: Bivalvia) [J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2011, 35(5): 874—881 [劉君, 李琪, 孔令鋒,等. 基于線粒體COⅠ的DNA條形碼技術在貽貝科種類鑒定中的應用. 水生生物學報, 2011, 35(5): 874—881]

[26] Costa F O, deWaard J, Boutillier J, et al. Biological identifications through DNA barcodes: the case of the Crustacea [J]. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 2007, 64: 272—295

[27] Zheng L, He M L, Jin J R, et al. Primary and secondary structure of 3’-end of the large subunit ribosomal RNA of silkorm Attacus ricini and evolution implications as Inferred from the gene sequence [J]. Acta Genetica Sinica, 1997, 24(4): 296—304 [鄭雷, 何明亮, 靳嘉瑞, 等. 蓖麻蠶核糖體大亞基RNA基因3′端序列分析及進化研究. 遺傳學報, 1997, 24(4): 296—304]

[28] Schubart C D, Diesel R, Hedges S B. Rapid evolution to terrestrial life in Jamaican crabs [J]. Nature, 1998, 393: 363—365

PHYLOGENETIC RELATIONSHIP AND TAXONOMIC STATUS OF FOUR DAPHNIA SPECIES BASED ON 16S rDNA AND COⅠSEQUENCE

XU Min, ZHANG Hai-Jun, DENG Dao-Gui, WANG Wen-Ping, ZHANG Xiao-Li and ZHA Ling-Sheng
(Anhui Key Laboratory of Resource and Plant Biology, School of Life Science, Huaibei Normal University, Huaibei 235000, China)

To examine the systematic classification of four previously-recorded Daphnia species, D. carinata, D. hyalina, D. pulex, and D. magna, genomic DNAs of these species were extracted and PCR was used to amplify fragments of 16S rDNA and COⅠ gene by employing specific primers. The sequences of amplified fragments were compared with Daphnia species from the GeneBank. Based on 16S rDNA and COⅠ gene, the average interspecific similarity rate of four Daphnia species was 85.25% and 80.67% respectively, and the content of A+T was obviously higher than that of G+C. The similarity of D. carinata from Lake chaohu and D. similoides (AB549199) from the GeneBank was 99% according to COⅠ gene and the divergence rate was 0.4%—0.9%. D. hyalina from Lake Chaohu was more close to D. galeata from the GeneBank based on 16S rDNA or COⅠgene. Main branches of both NJ tree and bayes tree were similar. The results indicated that D. carinata and D. similoides were the same species, and D. hyalina belongs to D. galeata. Due to the lack of nuclear gene analysis, the classification status of Daphnia species in Lake Chaohu needs further investigation.

Daphnia; 16S rDNA; COⅠgene; Systematic classification

Q951+.3

A

1000-3207(2014)06-1040-07

10.7541/2014.153

2013-10-09;

2014-03-11

國家自然科學基金 (31370470)資助

徐敏(1983—), 女, 安徽蒙城人; 碩士研究生; 研究方向為浮游生物系統(tǒng)進化。E-mail: minxuzheng@126.com

鄧道貴, E-mail: dengdg@263.net