孫燕 路春梅 侯雪晶

妊娠期高血壓疾病(HDCP)是孕產(chǎn)婦和圍生兒發(fā)病率及死亡率升高的主要原因之一。近年來越來越多的證據(jù)表明妊娠期高血壓疾病與遺傳學(xué)因素有著密切的關(guān)系［1］。研究表明，妊娠期高血壓疾病患者血漿兒茶酚胺(CA)，尤其是去甲腎上腺素(NE)水平明顯高于正常孕婦［2］，而單胺氧化酶A(MAO-A)主要分布在兒茶酚胺能神經(jīng)元中，在妊娠期母體、胎盤、胎兒之間的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用［3］，它是 CA 代謝過程中的主要降解酶，Cesura等［4］研究表明，MAO-A主要代謝NE和5-HT，其活性的高低影響CA的含量，MAO-A可能直接或間接地參與了妊娠期高血壓疾病的發(fā)生。故MAO-A編碼基因的多態(tài)性可能與妊娠期高血壓疾病的發(fā)病有關(guān)。因此本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCRRFLP)方法檢測MAO-A基因EcoRV酶切位點(C/T)的基因型，并對該多態(tài)性與HDCP進行關(guān)聯(lián)分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年6月至2013年7月在秦皇島市第一醫(yī)院產(chǎn)科住院并分娩的妊娠期高血壓疾病患者共100例(病例組)，其中妊娠期高血壓28例，輕度子癇前期26例，重度子線前期46例，平均年齡(26.13 ±3.23)歲;平均孕周(35.85 ±1.07)周。同期隨機抽取在秦皇島市第一醫(yī)院產(chǎn)科門診體檢及住院的健康正常孕婦共90例，平均年齡(25.25±2.89)歲;平均孕周(37.81±0.85)周。2組孕婦均為河北籍漢族人，均為單胎、初產(chǎn)，均無高血壓、心臟病、腎病、糖尿病及肝病等病史，均無輸血史，無免疫性疾病及免疫治療史。HDCP的診斷標準參照樂杰主編的第七版《婦產(chǎn)科學(xué)》中的標準。

1.2 方法

1.2.1 提取DNA:受檢者在知情同意后未進行處理前采集每位研究個體的靜脈血1 ml，經(jīng)枸櫞酸鈉抗凝后，采用 Tris-HCl飽和酚-氯仿 /異戊醇經(jīng)典方法提取DNA。

1.2.2 PCR反應(yīng):查找基因庫并參考文獻后設(shè)計引物序列。引物由上海生物工程公司合成。上游引物為:5’-TTGACACTGATAGAATCTG-3’;下游引物為:5’-GATCACAAGGCTTTATTCTA-3’。PCR反應(yīng)體系為50 μl，95℃預(yù)變性 5 min，然后 94℃變性 35 s、50℃退火40 s、72℃ 延伸 45 s，35 個循環(huán)后，72℃ 終末延伸4 min。取1%的瓊脂糖凝膠對上述產(chǎn)物進行電泳鑒定，同時選擇2 000 bp DNAmarker同時水平電泳，電泳結(jié)束后，取出凝膠，紫外儀下與DNA Marker跑出的條帶相比較，同時判定擴增片段長度。

1.2.3 酶切:MAO-A基因EcoRV酶切位點的PCR產(chǎn)物的電泳條帶為782 bp，PCR產(chǎn)物用EcoRV內(nèi)切酶進行酶切，酶切體系為 20 μl，其中:滅菌去離子水7.3 μl、The Multi-core Buffer 2 μl、PCR 產(chǎn)物 10 μl、EcoRV 內(nèi)切酶(10 U/μl)0.5 μl。于 37℃孵育箱中酶切14～16 h后，再經(jīng)1%瓊脂糖電泳鑒定MAO-A基因型。C/C基因型不可被酶切，電泳條帶為782 bp，T/T基因型可被酶切為618 bp和164 bp兩個片段，C/T基因型可被酶切為782、618和164 bp三個片段。見圖1。

1.2.4 PCR產(chǎn)物基因測序:選擇MAO-A基因EcoRV酶切位點的PCR擴增產(chǎn)物，隨機挑取各基因型1例行基因測序，以此來進一步判斷電泳所獲基因型的正確與否。

圖1 酶切后的電泳產(chǎn)物

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例組與對照組基因型頻率和等位基因頻率的比較 病例組和正常對照組的基因型分布都符合Hardy-Wein-berg平衡(P＞0.05)，說明群體基因遺傳平衡。病例組MAO-A基因EcoRV酶切位點的C和T等位基因頻率分別為70%、30%，與對照組MAO-A基因EcoR-V酶切位點的C和T等位基因頻率68.9%、31.1%比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.598，P=0.440)。病例組的C/C、C/T、T/T的基因型頻率分別為50%、40%和10%，與對照組的C/C、C/T、T/T的基因型頻率44.4%、42.2%和13.4%比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.820，P=0.664)。見表1、2。

2.2 病例組妊娠期高血壓、輕度及重度子癇前期各基因型分布情況 妊娠期高血壓組中妊娠期高血壓、輕度子癇前期、重度子癇前期間MAO-A基因型頻率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.205，P=0.379)。見表3。

表1MAO-A等位基因分布情況 例(%)

表2MAO-A基因型分布情況 例(%)

表3 病例組妊娠期高血壓、輕度及重度子癇前期各基因型分布情況例(%)

3 討論

娠期高血壓疾病是妊娠與血壓升高并存的一組疾病，發(fā)病率約5% ～12%［4］。該疾病嚴重影響母嬰健康，是孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒病死率升高的主要原因。其發(fā)病原因至今不明。2001年隨著眾多國家公布了人類基因組圖譜后，人類邁入了功能基因組學(xué)時代。個體基因組信息的獲得將使疾病的分類或分型從以臨床或病理為依據(jù)轉(zhuǎn)向以個體的基因差異為依據(jù)。由于妊娠期高血壓疾病具有較強的遺傳傾向，因此基因變異或多態(tài)性可能是該病發(fā)病的重要原因，故MAO-A編碼基因的多態(tài)性可能與妊娠期高血壓疾病的發(fā)病有關(guān)。

單胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO，EC1.4.3.4)，全名為單胺:O2氧化還原酶，是機體內(nèi)參與胺類物質(zhì)代謝的主要酶類，它的主要功能是催化內(nèi)源性和外源性單胺類物質(zhì)的代謝，氧化脫氨產(chǎn)生過氧化氫。根據(jù)底物選擇性和對抑制劑的靈敏度，單胺氧化酶被分為A(MAO-A)和B(MAO-B)兩種，MAO-A主要分布在兒茶酚胺能神經(jīng)元中，對底物血清素(5-HT)、NE、DA和抑制劑clorgylinc具有高親和性。HDCP患者交感神經(jīng)緊張性增加，血中CA尤其是NE水平增高，可能與HDCP的發(fā)病相關(guān)。MAO-A是CA代謝過程中的主要降解酶，其活性的高低影響CA的含量，CA的增高可能與MAO-A活性降低，CA的滅活減少有關(guān)，MAO-A可能直接或間接地參與了妊娠期高血壓疾病的發(fā)生。由于妊娠期高血壓疾病具有較強的遺傳傾向，因此基因變異或多態(tài)性可能是該病發(fā)病的重要原因，故MAO-A編碼基因的多態(tài)性可能與妊娠期高血壓疾病的發(fā)病有關(guān)。EcoRV酶切位點位于MAO-A基因第14外顯子上，由C、T兩種等位基因構(gòu)成。該多態(tài)性雖然沒有改變該基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的堿基組成，但與細胞中MAO-A活性相關(guān)。其中T等位基因含EcoRV酶切位點，與MAO-A高酶活性相關(guān)聯(lián)，而C等位基因不含EcoRV酶切位點，與MAO-A低酶活性相關(guān)聯(lián)［優(yōu)勢比(odds ratio，OR;OR=6.0)］［5］。本研究測定了100例HDCP患者及90例健康對照組孕婦的MAO-A基因EcoRV酶切位點的基因型。測得HDCP組MAOA基因EcoRV酶切位點C/C、C/T、T/T各基因型的頻率分別為:50%、40%和10%，對照組分別為:44.4%、42.2%和 13.4%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.820，P=0.664)。HDCP組MAO-A基因EcoRV酶切位點C、T等位基因的頻率分別為:70%和30%，對照組分別為:68.9%和31.1%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.598，P=0.440)。病例組中妊娠期高血壓、輕度子癇前期、重度子線前期C/C、C/T、T/T各基因型的頻率分別為:50%、38.5%、56.5%;35.7%、46.2%、39.1% 和14.3%、15.3%、4.4%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.205，P=0.379)。說明MAO-A 基因EcoRV 酶切位點的多態(tài)性沒有如預(yù)期的那樣可能通過引起CA的升高，對妊娠期高血壓疾病的發(fā)病起作用。雖然我們的研究顯示MAO-A基因EcoRV酶切位點基因多態(tài)性與HDCP發(fā)病無相關(guān)性，等位基因C并沒有增加妊娠期高血壓疾病的發(fā)病風(fēng)險。但是MAO-A基因有多個遺傳多態(tài)性位點，本研究僅探討了其中的一個多態(tài)性位點，MAO-A基因EcoRV酶切位點的多態(tài)性亦有可能與MAO-A的其他多態(tài)性位點連鎖不平衡，影響CA的含量，而對HDCP的發(fā)病起作用。其次，不同種族和群體的遺傳背景有差異，MAO-A基因EcoRV酶切位點的基因型在不同種族和群體中分布頻率不一，因而我們不能斷言MAO-A基因EcoRV酶切位點的多態(tài)性與HDCP的發(fā)病絕對無關(guān)。尚有待大樣本多位點的綜合分析來進一步探討MAO-A基因EcoRV酶切位點的多態(tài)性與HDCP的關(guān)系。

1 Paula J.Williams and Fiona Broughton Pipkin.The genetics of pre-eclampsia and other hypertensive disorders of pregnancy.Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol，2011，25:405-417.

2 Kaaja RJ，Leinonen A，Moore P，et al.Effect of changes in body posture on vasoactive homones in pre-eclamptic women.HUM Hypertens，2004，18:789-794.

3 Zhang H，Smith GN，Liu X，et al.Association of MAOA，5-HTT，and NET promoter polymorphisms with gene expression and protein activity in human placentas.Physiol.Genomics，2010，42:85-92.

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5 Antoniou AN，F(xiàn)ord S，Pilley ES，et al.Interactions formed by individually expressed TAP1 and TAP2 polypeptide subunits.Immunology，2002，106:182-189.