申偉崧，劉 毅*，陳效毅

(1.徐州醫(yī)學院 藥學院，江蘇 徐州 221004；2.徐州市化工研究所，江蘇 徐州 221007)

銀杏(GinkgobilobaL.) 為銀杏科銀杏屬多年生落葉喬木，又名白果，是我國特有物種，也是我國獨特的藥用植物資源。銀杏外種皮是種子硬殼外面的肉質部分，長期以來，被作為廢棄物被丟棄，造成了資源浪費。銀杏外種皮中還含有酚酸性的成分，隨意丟棄改變土壤成分和水質，不僅污染土壤還毒死魚蝦，且銀杏外種皮具有刺鼻的臭味，也造成了空氣的污染[1]。銀杏外種皮中的多糖成分含量很高，約含10%以上，粗多糖為黃褐色粉末狀，無異味，微甜，對人體無毒副作用，且具有抗炎，抗腫瘤，抗衰老以及增強免疫等多種功能[2-7]，有較好地開發(fā)和應用價值。

目前，對銀杏外種皮多糖的提取方法研究多集中于加熱浸提和超聲輔助提取，微波輔助提取的研究鮮有報道。微波輔助浸提技術是近年發(fā)展起來的一種新型物理破壁方法，其原理是利用微波輻射壓強產生的騷動效應、空化效應和熱效應引起機械攪拌、加速了細胞內物質的擴散溶解。與傳統(tǒng)熱水浸提方法相比，具有節(jié)能、快速、效率高等優(yōu)點，而超聲輔助雖采取相似的原理，但往往需要相對較長的處理時間。本文采用響應面分析法對微波輔助提取銀杏外種皮多糖進行研究[8]，對充分利用銀杏資源，減少環(huán)境污染，提高銀杏的經濟總量，具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

銀杏外種皮(采于江蘇姜堰，干燥后，除雜粉碎，過40目篩，制成銀杏外種皮粉末備用)

1.2 儀器

752N紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)，FA1004B電子天平(上海精密科學儀器有限公司)，TDA溫度控制儀(北京永光明醫(yī)療儀器廠)，FW100高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)，DS-1真空冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)，EM-202MS1微波爐(榮事達三洋電器股份有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 銀杏多糖的含量測定

本實驗采用硫酸-苯酚法測定多糖含量[9]。

稱取105 ℃干燥恒重的葡萄糖5.2 mg、10.1 mg、20.2 mg、25.2 mg，分別置于100 mL容量瓶中，定容，搖勻。分別移取2ml標準溶液于燒杯中，加入6%苯酚溶液1 mL以及濃硫酸5 mL，靜置30 min，至室溫，于490 nm下測定吸光度A。以葡萄糖含量為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制標準曲線。

圖1 硫酸-苯酚法標準曲線

標準曲線的回歸方程為：y=0.6936x+0.6177，方程擬合度R2=0.9994，線性關系良好。

1.3.2 銀杏外種皮多糖的提取[10-12]

準確稱取銀杏外種皮粉末1 g，按一定的料液比加入蒸餾水進行微波處理，在沸水浴中浸提一段時間，4層紗布過濾，重復3次操作，合并濾液，濃縮，醇沉，抽濾，用無水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌濾餅，冷凍干燥，得到粗多糖。

1.3.3 單因素實驗

實驗以1 g銀杏外種皮為原料，對微波處理時間、料液比、浸提時間[11]3個因素進行單因素的研究，分別討論其對多糖收率的影響。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 微波時間對銀杏外種皮多糖收率的影響

在5個三角燒瓶中加入1 g銀杏外種皮，按料液比25 mL·g-1加入蒸餾水，分別在功率700 W下微波處理6、8、10、12、14 min，然后在沸水浴中浸提2.5 h，3 000 r/min離心30 min，取上清液測定多糖含量。結果如圖2所示。

圖2 微波時間對銀杏多糖收得率的影響

由圖2可知，微波輔助處理6～12 min之間，銀杏外種皮多糖收得率隨著微波輔助處理的時間增加而增加，且增加趨勢顯著?？赡苡捎谖⒉〞r間過長，導致多糖焦化或水解，超過12 min后多糖的收得率有所下降。故微波輔助處理時間選擇12 min為宜。

2.1.2 料液比對銀杏外種皮多糖收率的影響

在5個三角燒瓶加入1g銀杏外種皮，分別加入10、15、20、25、30 mL蒸餾水，在功率700 W下微波處理12 min，然后在沸水浴中浸提2.5 h，3 000 r/min離心30 min，取上清液測定多糖含量。結果顯示如圖3所示。

圖3 料液比對銀杏多糖收得率的影響

由圖3所示，隨著料液比的增加，銀杏外種皮多糖得率也隨之增加，當料液比達到1∶30時，多糖收得率增加趨勢明顯，但料液比在10～25時，增長幅度較大，超過25后收率增加緩慢。由于初期加水過多會引起后續(xù)濃縮醇沉操作時長增加，造成能源浪費，故選擇料液比為1∶25較為適宜。

2.1.3 浸提時間對銀杏外種皮多糖收率的影響

在5個三角燒瓶加入1 g銀杏外種皮，按料液比25 mL·g-1加入蒸餾水，在功率700 W下微波處理12 min，然后在沸水浴中分別浸提1、1.5、2、2.5、3 h，3 000 r/min離心30 min，取上清液測定多糖含量。結果顯示如圖4所示。

圖4 浸提時間對銀杏外種皮多糖收得率的影響

由圖4可知，在3 h之內銀杏外種皮多糖收得率隨著浸提時間的增加而增加，但浸提時間超過2 h，由于多糖濃度趨于飽和，得率趨于平緩。從節(jié)約多糖制備后續(xù)工藝的時間和節(jié)約資源的原則出發(fā)，浸提時間選擇2.5 h較為合適。

2.2 響應面分析

2.2.1 響應面分析實驗

為克服單因素輪換法實驗存在無法判定各因素對反應影響的主次關系和不易尋找最佳反應條件組合等問題。基于單因素實驗，以多糖收率為響應面值，根據Box中心組合設計原理[13]設計三因素三水平響應面分析實驗，對銀杏外種皮多糖提取工藝進行優(yōu)化，共有15個實驗點，其中12個為分析因子，3個為零點。零點實驗進行3次，以估計誤差。見表1和表2。

表1 響應面實驗因素與水平表

表2 響應面分析實驗結果

用SAS中的響應面回歸Rereg程序[13]對表4中的數據進行回歸分析，回歸擬合方程為：

(3)

方程Y各項回歸系數具體數值和方差分析見表3和表4。并運用SAS，對回歸模型進行規(guī)范形分析，可得響應面等值線分析圖，如圖5、圖6和圖7所示。

表3 回歸方程中回歸系數表

表4 回歸方程方差分析

圖5 微波時間和料液比

圖6 微波時間和浸提時間

圖7 料液比和浸提時間

各項方差分析結果表明，方程一次項和二次項都有較高的顯著性，說明微波作用時間、料液比和浸提時間三因素對消旋率的影響不是單一線性關系。交互項均不顯著，說明三因素之間的相互影響對響應值的影響可忽略不計。失擬項F不顯著，誤差均方根(Root MSE)為0.025 8，判定系數(R-Square)為0.999 8，表明該方程對實驗擬合情況良好，試驗誤差小。從規(guī)范形分析所得的等值線圖可以較直觀地看出各因素較好的取值范圍，及微波作用時間和浸提時間是影響銀杏外種皮多糖提取的重要因素，其次是料液比。

2.2.2 微波輔助銀杏外種皮多糖提取優(yōu)化及驗證

應用Box的Complex Algorithm法對上述回歸方程取一階偏導數并令其等于零，可得X1、X2和X3的值分別為0.674、0.833和0.473，經換算為原變量取值是反應條件在料液比29.17加入蒸餾水，在功率700 W下微波處理13.35 min，然后在沸水浴中浸提2.74 h，反應可以取得最佳的響應值，在此條件下模型預測最佳響應值為14.135%。為便于實際操作取料液比29，在功率700 W下微波處理13 min，然后在沸水浴中浸提2.75 h，為最佳反應條件。以RSM所得最佳條件進行3次實驗，分別得到多糖收率為13.92%、13.97%和13.85%，平均值為13.91%，逼近模型預測的最佳響應值。

3 結 論

將微波技術應用于銀杏外種皮多糖的提取，并用響應面分析法優(yōu)化提取工藝，采用合理的實驗設計，依據回歸分析確定各因素對多糖得率的影響，取得了比較好的結果，經優(yōu)化后確定超聲波輔助提取黑木耳多糖的最佳工藝條件為: 料液比29，在功率700 W下微波處理13 min，然后在沸水浴中浸提2.75 h，多糖收率為13.913%。

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