戚曉利，趙樹堂，韓誠武，張麗敏，張海軍，申 健，王 波

(1.佳木斯大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，佳木斯 154007；2.林木遺傳育種國家重點實驗室，中國林業(yè)科學(xué)研究院，北京 100091)

擬南芥(Arabidopsisthaliana)屬十字花科植物，又名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草。它具有植株矮小、生長周期短、結(jié)籽多、生活力強、基因組小等特點[1]，作為遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究的模式生物之一，尤其在植物發(fā)育生物學(xué)研究中扮演了十分重要的角色，被國內(nèi)外許多實驗室廣泛種植。目前國內(nèi)很少有實驗室具備國外標準化人工氣候室，如何在簡陋條件下培養(yǎng)成為國內(nèi)外許多實驗室面臨的問題。2011年本課題組承擔了國家科研院所公益基金合作項目，將胡楊BIBAC文庫中的基因大片段轉(zhuǎn)入擬南芥，由于東北地區(qū)干燥寒冷的氣候特點，擬南芥的培養(yǎng)遇到各種問題，影響科研工作的進展。因此，本研究結(jié)合東北地區(qū)的實驗條件和氣候特點，主要在擬南芥的播種方法、溫度、光照條件、病蟲害防治等方面進行了探索改進，根據(jù)實驗室栽種的長期實踐總結(jié)出一套適合東北寒冷氣候特點的擬南芥培養(yǎng)方法，供同行參考。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥種子(ArabidopsisthalianaColumbia)由中國林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國家重點實驗室提供、MS培養(yǎng)基、培養(yǎng)基質(zhì)(營養(yǎng)土∶蛭石=1∶1)、1/2MS營養(yǎng)液。

1.2 方法

土壤育苗法：取育種盤裝培養(yǎng)基質(zhì)(營養(yǎng)土∶蛭石=1∶1)約4 cm厚，加水使土壤充分吸水濕透，取擬南芥種子，直接播撒在土壤表面。播種后覆蓋薄膜保濕(薄膜上扎孔利于通氣)，放入培養(yǎng)室進行人工光照培養(yǎng)。當2片子葉完全伸展時，去除其上覆蓋的薄膜，于2片真葉期移栽。

基質(zhì)育苗法：將種子消毒后撒播于無菌MS培養(yǎng)基內(nèi)，光照培養(yǎng)，2片真葉期移栽到培養(yǎng)基質(zhì)中。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)方法的比較

培養(yǎng)基質(zhì)是擬南芥生長中的關(guān)鍵因素，蛭石質(zhì)地疏松，通氣性好，利于幼苗生根。為了保證提供充足的營養(yǎng)與良好的通氣透水性，將蛭石、營養(yǎng)土按1∶1的比例混勻[2]。培養(yǎng)基質(zhì)裝盆時，選用干基質(zhì)要優(yōu)于濕基質(zhì)，可避免裝盆時培養(yǎng)基質(zhì)的黏結(jié)，保證培養(yǎng)基質(zhì)的通透性而利于扎根。干基質(zhì)裝入塑料缽后，將塑料盆放入盛有水的平底塑料托盤中，采用底盤吸水法讓水分通過毛細管作用由下至上順著塑料盆底部的小孔自然滲入培養(yǎng)基質(zhì)中，吸透水后將塑料托盤內(nèi)多余水倒出，即可進行移栽。幼苗移栽后因環(huán)境條件的變化，需經(jīng)過一定時間的緩苗期才能正常生長。移栽時選擇壯苗(株型矮壯，葉色深綠，大小整齊)移栽。土壤育苗法移栽時要多帶護根土，避免損傷根系而影響其成活率?；|(zhì)育苗法移栽時將根部附帶的培養(yǎng)基水洗干凈再移入培養(yǎng)基質(zhì)中，每株擬南芥占約5 cm2空間即可。移栽時擬南芥的苗齡對其成活率有很大影響，故要做到適時移栽。最好選擇陰天或傍晚時分移栽，移栽后蓋膜緩苗2 d，去除薄膜正常培養(yǎng)。

基質(zhì)培養(yǎng)法與土壤培養(yǎng)法相比較而言，基質(zhì)培養(yǎng)法保證了出苗的一致性，生長周期略短，缺點是幼苗在移栽到土壤后，對環(huán)境的適應(yīng)性差，前期種子的消毒，培養(yǎng)基的配置要求無菌操作，增加了工作負擔。

可根據(jù)實驗的具體情況擇優(yōu)選擇。本課題以轉(zhuǎn)基因為目的實驗，轉(zhuǎn)化后需要利用抗生素進行轉(zhuǎn)基因植株篩選，此時優(yōu)選基質(zhì)培養(yǎng)法，將作為對照的野生型擬南芥直接移入土壤中培養(yǎng)，既節(jié)時又省力。

2.2 播種

擬南芥種子表面甚至內(nèi)部帶有病菌，將直接傳給幼苗和成株，造成病害發(fā)生，所以播前進行種子消毒對提高播種質(zhì)量，培育無病灶苗具有重要意義[3]。種子消毒常用方法有藥粉拌種、藥液浸種。本實驗選用轉(zhuǎn)基因植株篩選的種子滅菌法，在超凈工作臺中將種子至于滅菌的濾紙上，噴灑70%的酒精浸種10 min，噴灑無水酒精，酒精揮發(fā)后將一部分種子收集到Eppendorf管中備用，一部分播于MS培養(yǎng)基中作為篩選轉(zhuǎn)基因植株的對照。此方法可避免采用殺菌劑對環(huán)境的污染和人體的危害，又與后期轉(zhuǎn)基因篩選實驗密切相結(jié)合，減少工作量。收獲的種子干燥后一般置于4 ℃冰箱內(nèi)保存，在此條件下保存一個月以上的種子可不必低溫處理，直接用于播種[4]。

2.3 培養(yǎng)條件

2.3.1 溫度

擬南芥不耐高溫，最適溫度在(22±2) ℃。溫度過高則擬南芥長勢弱，生殖期提前，還易引發(fā)各種病蟲害，溫度過低則生長發(fā)育周期延長。夏季時期要特別注意避免斷電或空調(diào)故障而使溫度長時間失控。本課題組培養(yǎng)室在4～10月份主要依靠空調(diào)控溫，黑龍江的冬季(11～3月)室外溫度低，主要采取集中供暖，白天室內(nèi)溫度約15 ℃，夜間溫度為8 ℃左右，低溫對擬南芥的培養(yǎng)提出挑戰(zhàn)。試驗比較了擬南芥在人工光照(白色熒光燈，16 h光照8 h黑暗，光照強度70 μmol/m2s)條件下二種溫度土培擬南芥的生長情況(表1)。由表1可以看出，11～3月份播種的擬南芥植株，始花時間、蓮座直徑、植株總高、生長周期等指標均高于4～10月份，植株葉片顏色深綠，花序高而粗，植株健壯，果莢大、種子飽滿。這是因為氣溫低，營養(yǎng)生長旺盛，利于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化用苗。缺點是生長周期長，延長了實驗周期。擬南芥培養(yǎng)溫度總體掌握的原則是“寧低勿高”，可以根據(jù)不同的試驗?zāi)康暮腿〔男枰?，進行分期播種。只要嚴格掌握春化、播種、育苗、移栽、管理一整套的栽培技術(shù)，成活率均可達95%。

表1 擬南芥的生長情況

2.3.2 濕度

擬南芥喜濕潤，生長環(huán)境的空氣相對濕度比較高時有利于擬南芥生長。本培養(yǎng)室的條件達不到其對濕度的要求，保濕方法主要是在地面潑水并不定期噴霧小苗的方法增加濕度。

2.3.3 光照

根據(jù)實驗的目的調(diào)節(jié)光照強度和光照時間。擬南芥屬長日照植物，光照強度大和光照時間長，可以促進生殖生長，縮短收獲種子的時間[5]。植物生長燈均有獨立開關(guān)，光照強度可通過開關(guān)燈管數(shù)量控制。本室冬季一般采用16 h光照和8 h黑暗條件培養(yǎng)擬南芥，或者根據(jù)需要增加光照時間、光照強度以縮短生長周期。夏季時先將植物置于8 h光照和16 h黑暗的短光照條件下培養(yǎng)(從移苗開始約需4 周)，再移至長光照下誘導(dǎo)開發(fā)，以促進植物營養(yǎng)生長。植物轉(zhuǎn)化完后，可在24 h光照條件下培養(yǎng)，促進種子的成熟。光照除選用植物生長燈外，適當補充黃色光源，利于植物生長。

2.3.4 肥水管理

擬南芥耗水強度隨生育進程而改變，耗水量以苗期最大，果期最少。澆水原則是“不干不澆，澆則澆透”。切忌過量灌水，避免表層藻類和真菌產(chǎn)生，不利于植株生長，更易招致蠅類、蛆類害蟲的產(chǎn)生。

當擬南芥植株葉片深綠色時，表明土壤肥力夠；當植株呈現(xiàn)出輕微淡綠色時，表明營養(yǎng)供給不足，應(yīng)立即施以1/2MS營養(yǎng)液。本實驗是在幼苗期、抽苔前分別追施一次1/2MS營養(yǎng)液。

2.3.5 病蟲害防治

培養(yǎng)室中擬南芥病蟲害的防治是一項長期工作，需要從實際情況出發(fā)，根據(jù)實驗室的環(huán)境條件、季節(jié)情況、擬南芥的不同生長時期，采用適當?shù)姆椒ㄟM行防治。課題組主要采用嚴格控制室內(nèi)溫度預(yù)防病蟲害的發(fā)生，利用黃板誘殺果蠅及溫室白粉虱。培養(yǎng)基質(zhì)表面有長綠色青苔現(xiàn)象，通過控制澆水量，放置風扇增加空氣流通可以得到有效解決?？傮w原則是防大于治，將盡可能將病蟲害消滅于初發(fā)狀態(tài)。

3 討 論

擬南芥生長的最適溫度一般是(22±2) ℃，光照60～100 μmol/m2s左右較好。但各實驗室條件和國內(nèi)各地的氣候條件均不相同。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥移栽后其生長周期、形態(tài)特征會受到光照、溫度等外界因素的影響[6]，因此要根據(jù)實際情況適時調(diào)整培養(yǎng)條件。東北地區(qū)冬季漫長，氣溫低而干燥，不利于擬南芥的生長，夜晚氣溫持續(xù)低溫時，擬南芥蓮座葉變紫；如果在夏季，室溫連續(xù)超過28 ℃以上時，擬南芥的營養(yǎng)生長期縮短，抽苔早，花序矮而細弱，不利于基因的轉(zhuǎn)化工作。冬季室內(nèi)氣溫低時，可在培養(yǎng)架周圍包裹塑料薄膜以保溫，通過延長光照時間、增加光照強度等因素而縮短其生長周期；夏季嚴格控制室內(nèi)溫度，可適當縮短光照周期和光照強度。通過實驗室的多年工作實踐，本文不僅為研究者提供了東北地區(qū)種植擬南芥的資料，而且對擬南芥的種植、管理細節(jié)進行了分析。試驗表明，在東北地區(qū)室內(nèi)低溫條件下完全可種植擬南芥，改進的培養(yǎng)方法能較好地滿足研究者的實驗需要。

參考文獻：

[1] Pruitt R E，Meyerowitz E M.Characterization of the genome ofArabidopsisthaliana[J].Mol Biol，1986，187：169-183.

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[3] 李玲，劉開泉，劉炳福，等.擬南芥培養(yǎng)中病蟲害的發(fā)生與防治[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(11)：85-86.

[4] 李俊華，張艷春，徐云遠，等.擬南芥室內(nèi)培養(yǎng)技術(shù)[J].植物學(xué)通報，2004，21(2)：201-204.

[5] 李玲，劉炳福，劉開泉，等.冬季擬南芥土培室與大棚培養(yǎng)技術(shù)的對比研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(10)：55-57.

[6] 王瑜，曾幼玲，黃萍，等.擬南芥在新疆干旱地區(qū)的室內(nèi)栽種及遺傳轉(zhuǎn)化[J].生物技術(shù),2008，18(3)：69-71.