韓晨晨，程丹丹，張穎穎，高德民*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 濟南 250355)

中藥石韋為水龍骨科(Polypodiaceae)植物石韋屬(Pyrrosia)有柄石韋的地上部分[1]。性甘、苦，微寒。歸肺、膀胱經(jīng)。具利水通淋，清肺泄熱之功效，可治淋痛，尿血，尿路結(jié)石，腎炎，崩漏，痢疾，肺熱咳嗽，慢性氣管炎，金瘡，癰疽等[2]。石韋煎劑對金黃色葡萄球菌、變形桿菌、大腸桿菌等有不同程度的抑制作用[3]。臨床中用石韋治療支氣管哮喘、慢性支氣管炎、急、慢性腎炎及腎盂腎炎等疾病，具有較好的效果。

黃酮類化合物是天然的抗氧化劑，具有清除人體中超氧離子自由基的生理活性，且具有抗癌、抗衰老和抗氧化等多種藥理作用，因此對有柄石韋中黃酮類成分提取純化工藝的探討具有重要意義。

1 儀器與試劑

1.1 材料

有柄石韋(購自建聯(lián)中藥店)。

1.2 主要試劑

蘆丁對照品(生化試劑，上海阿拉丁試劑有限公司)，乙酸乙酯、正丁醇、乙醚(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)和石油醚(天津市達森化工產(chǎn)品銷售有限公司)均為分析純。95%乙醇、亞硝酸鈉(AR)、氫氧化鈉(AR)、三氯化鋁(AR)。

1.3 儀器

DS-T250高速多功能粉碎機(上海市頂帥工貿(mào)有限公司)；SHB-III循環(huán)水多用真空泵(菏澤市鑫源儀器儀表有限公司)；RE52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(菏澤市鑫源儀器儀表有限公司)； HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋(濟南啟科儀器設(shè)備有限公司)；PS-40A超聲波清洗機(深圳市超藝達科技有限公司)；754PC紫外-可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃酮類成分的分離純化

取藥材洗凈，自然風(fēng)干，粉碎機粉碎后過40目篩，稱量270 g。將有柄石韋置于燒杯中用石油醚浸泡過夜。將藥液抽濾，向藥渣中加入70%濃度的乙醇[4]超聲，回流浸提，抽濾得濾液，濾液減壓濃縮并回收乙醇，得浸膏。浸膏在水浴鍋上蒸干，水溶浸膏并用石油醚多次萃取，下層平均分成9份，待用，水溶后分別用乙酸乙酯、正丁醇、乙醚在不同因素下萃取，分離時各因素水平如下表[5-6]：

表1 因素水平表

表2 L9(34)正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析

將分別用乙酸乙酯、正丁醇、乙醚萃取得到的黃酮提物旋蒸后置于水浴鍋上蒸干，稱重。

2.2 黃酮類成分的測定

準(zhǔn)確稱取蘆丁對照品3.5 mg，用70%乙醇溶解并定容至50 mL，搖勻得濃度為0.070 0 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。用該溶液配制十份不同梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并顯色，用紫外可見光分光光度計在510 nm處測量吸光值。以濃度對吸光度值做標(biāo)準(zhǔn)曲線[7]。，所得黃酮回歸方程為，y=6.8302x+0.0052；r=0.9997同樣方法測定九份樣品提取物的吸光度。由回歸方程及稀釋的關(guān)系計算出每份中黃酮濃度及含量。結(jié)果見表2。

3 結(jié) 論

3.1 結(jié)果分析

由表2可知，4個因素對分離純化效果影響的主次順序為萃取溶劑>萃取次數(shù)>萃取溶劑用量>萃取時間。萃取溶劑和萃取次數(shù)是主要影響因素，萃取時間和每次萃取溶劑的量次之。故應(yīng)選A2B1C2D2為分離純化的最佳方案。

3.2 驗證試驗

根據(jù)正交試驗結(jié)果對A2B1C2D2條件進行3次實驗，結(jié)果無顯著差異。本次試驗最佳分離純化工藝為200 mL的正丁醇萃取4次，每次萃取30 min。

4 討 論

本研究以中藥有柄石韋為研究對象，采用乙醇熱回流法提取其中的總黃酮，并用不同的有機溶劑萃取分離，并運用紫外分光光度法在波長510 nm處對黃酮含量進行了測定。通過正交試驗法對提取工藝條件進行優(yōu)化，并進行了驗證試驗，結(jié)果顯示最佳提取工藝為200 mL的正丁醇，萃取4次,每次萃取30 min。

研究表明，黃酮類化合物具有抗過敏、降血壓、抗炎、抗菌、抗突變、抗?jié)?、抗病毒、保肝和降血脂等活性[8]。黃酮作為重要的藥效成分在有柄石韋中有著豐富的種類和較高的含量。本研究對有柄石韋中黃酮類成分分離純化工藝進行優(yōu)選，以使石韋中黃酮類有效成分能夠充分的被人類利用，同時提高了石韋資源的利用率，減少了不必要的浪費，對于建設(shè)資源節(jié)約型社會具有重大的意義，為進一步對黃酮類成分的理化性質(zhì)的研究提供有利的條件。

參考文獻：

[1] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志：第62卷[M].北京：科學(xué)出版社，2000：116.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000: 68.

[3] 陳 露，劉布鳴，馬軍花，等.中藥石韋的研究概況[J].廣西醫(yī)學(xué)，2011，33(11)：1486-1489.

[4] 鄧源喜，李妍，許暉，等.荷葉中黃酮提取及測定方法的研究進展[J].飼料研究，2011(5)：18-20.

[5] 王自軍，楊紅兵，齊譽，等.正交設(shè)計研究石韋總黃酮和鞣質(zhì)提取工藝[J].時珍國醫(yī)國藥，2007,18(2)：463-464.

[6] 易俗，王瑞蘭，譚新中，等.廬山石韋總黃酮的提取工藝初探[J].湘潭師范學(xué)院學(xué)報，2004,26(1)：76-78.

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[8] Parellade J,Guinea M.Flavonoid inhibitors of typsin and leucine aminopeptidase: A proposed mathematical model for IC50 Estimation[J].J Nat Prod,1995,58(6): 823-829.