李敏芳，王雁飛，盧 莉

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與造模 健康成年BALB／c小鼠40只，雌雄各半，清潔級(jí)，體重24 g～26 g，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室。室內(nèi)溫度21℃～23℃，濕度50%左右，自然晝夜節(jié)律光照，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。隨機(jī)分為4組，每組10只，對(duì)照組，5 d、10 d、15 d應(yīng)激組。參照造模方法［1］將小鼠束縛于自制的束縛筒內(nèi)［2］，應(yīng)激組小鼠接受束縛應(yīng)激，6 h／d，每次開(kāi)始束縛的時(shí)間不同。15 d組持續(xù)束縛15 d，當(dāng)該組束縛5 d后，10 d組開(kāi)始接受束縛，連續(xù)10 d，10 d組進(jìn)行束縛應(yīng)激5 d后，5 d組再開(kāi)始接受束縛，連續(xù)5 d后，3組同時(shí)停止束縛應(yīng)激，造模結(jié)束。實(shí)驗(yàn)鼠在清醒、安靜狀態(tài)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)與處死。

1.2 主要試劑與設(shè)備 曠場(chǎng)試驗(yàn)所用敞箱［3］，為高20 cm、長(zhǎng)寬45 cm，四周涂為黑色，上面敞開(kāi)，底面用白線(xiàn)劃分為面積相等的25塊，沿墻格稱(chēng)外周格，其余為中央格。Q／GHSB 85-2001淋巴細(xì)胞分離液、p H 7.2～7.6 PBS緩沖液、ZS-2自動(dòng)酶標(biāo)監(jiān)測(cè)儀、TGL-16B高速臺(tái)式離心機(jī)、深圳晶華公司IL-4，TNF-γELISA試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 觀(guān)察體重行為變化 記錄每只小鼠在實(shí)驗(yàn)中的形態(tài)變化及飲食情況，比較體重改變的結(jié)果。

1.3.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) Open-Field法 造模結(jié)束，小鼠在安靜、暗光的環(huán)境下進(jìn)行曠場(chǎng)試驗(yàn)，將小鼠置于中央格內(nèi)然后計(jì)時(shí)，記錄小鼠在3 min內(nèi)中央格停留時(shí)間（潛伏期）、穿越臨格次數(shù)、理毛修飾次數(shù)（前肢抬舉，抓癢、洗臉、舔足等行為）及糞便次數(shù)。行為評(píng)定采用盲法，由三名觀(guān)察者進(jìn)行，攝像機(jī)記錄全程，最后請(qǐng)3位觀(guān)察者觀(guān)看錄像評(píng)分，取其均數(shù)。

1.3.3 血標(biāo)本采集 小鼠摘眼球取血置于抗凝管中，2500 r／min離心10min，3 7℃孵育3 h～4 h，取血清-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 檢測(cè)胸腺和脾臟指數(shù) 將處死小鼠分離脾臟和胸腺，生理鹽水沖洗，濾紙吸干表面液體，稱(chēng)重。計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

1.3.5 小鼠脾淋巴細(xì)胞 小鼠脾臟于300目不銹鋼網(wǎng)研磨，PBS緩沖液沖洗，濾液靜置5 min后吸取上清，沖洗2次，1 000 r／min離心10 min，2 m L PBS重懸；試管內(nèi)加入2 m L淋巴細(xì)胞分離液，并在其上加入2 m L細(xì)胞懸液，2 000 r／min離心10 min，離心后吸取兩層界面之間的脾淋巴細(xì)胞（霧狀層），置入另一試管，洗2次，每次1 000 r／min離心5 min，適量PBS重懸沉淀，計(jì)數(shù)。

1.3.6 腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞 無(wú)菌分離小鼠腸系膜淋巴結(jié)，在300目不銹鋼網(wǎng)過(guò)濾、沖洗、離心、沉淀、重懸計(jì)數(shù)。

1.3.7 細(xì)胞因子的檢測(cè) 用ELISA法測(cè)IFN-γ和IL-4的含量，具體步驟按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用獨(dú)立兩樣本t檢驗(yàn)；其他指標(biāo)用單因素方差分析，組間比較SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 行為及體重觀(guān)察 應(yīng)激組在3 d出現(xiàn)相互撕咬、煩躁、驚恐和敵意等異常行為，但體重增長(zhǎng)差異不明顯，4 d后隨時(shí)間延長(zhǎng)，應(yīng)激組則出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神萎靡、毛發(fā)灰暗，食欲不振、尿量增多、大便稀的現(xiàn)象；并且體重呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，與正常組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 心理應(yīng)激對(duì)小鼠曠場(chǎng)行為的影響 與對(duì)照組相比，應(yīng)激組小鼠在中央格停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，穿格次數(shù)顯著減少，糞便次數(shù)增多，組間修飾次數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其中15 d應(yīng)激組中央格停留時(shí)間、穿格次數(shù)和糞便次數(shù)與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）

表1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）

組別 n 中央格停留時(shí)間（秒） 穿格數(shù)（格） 修飾（次） 糞便（次）對(duì)照組 10 3.01±1.82 170.55±43.3 2.91±0.9 0.77±0.41 5 d應(yīng)激組 10 5.9±2.832）3）116.5±33.161） 2.94±0.85 2.78±1.611）3）10 d應(yīng)激組 10 8.12±2.522） 101.61±26.282） 3.12±0.98 5.10±1.492）15 d應(yīng)激組 1011.98±3.332） 94.83±26.132） 5.04±1.66 6.30±1.752）與對(duì)照組比較，1）P＜0．05，2）P＜0.01；與15 d應(yīng)激組比較，3）P＜0.05

2.3 應(yīng)激對(duì)小鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響 應(yīng)激組小鼠脾臟指數(shù)受到明顯抑制，明顯低于對(duì)照組（P＜0．05～P＜0.01），胸腺指數(shù)與對(duì)照組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表2。

表2 心理應(yīng)激對(duì)小鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響（±s）

表2 心理應(yīng)激對(duì)小鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響（±s）

組別 n 胸腺指數(shù)（mg／g） 脾指數(shù)（mg／g）對(duì)照組 10 0.52±0.17 4.41±0.70 5 d應(yīng)激組 10 0.48±0.19 3.41±0.611）10 d應(yīng)激組 10 0.50±0.21 3.06±0.351）15 d應(yīng)激組 10 0.51±0.23 2.73±0.502）與對(duì)照組比較，1）P＜0．05，2）P＜0.01。

2.4 小鼠脾淋巴細(xì)胞數(shù)量和腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞數(shù)量變化與對(duì)照組相比，5 d應(yīng)激組脾淋巴細(xì)胞數(shù)量和腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞數(shù)量都明顯降低（P＜0.05），10 d、15 d應(yīng)激組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。詳見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞和腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞數(shù)量變化±s） ×105

表3 各組小鼠脾淋巴細(xì)胞和腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞數(shù)量變化±s） ×105

組別 n 脾淋巴細(xì)胞 腸系膜淋巴結(jié)對(duì)照組 10 8.925±2.24 5.89±1.48 5 d應(yīng)激組 10 5.841±2.011） 4.10±0.961）10 d應(yīng)激組 10 4.92±1.562） 3.72±1.202）15 d應(yīng)激組 10 3.81±1.462） 3.02±0.112）與對(duì)照組比較，1）P＜0．05，2）P＜0.01。

2.5 各組小鼠血清中IFN-γ和IL-4水平及IL-4／IFN-γ的變化 與對(duì)照組比較，5 d應(yīng)激組血清中IFN-γ明顯降低（P＜0．05），且隨著應(yīng)激時(shí)間延長(zhǎng)而顯著下降（P＜0.01）。應(yīng)激組血清中的IL-4水平雖呈上升趨勢(shì)，但與對(duì)照無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IL-4／IFN-γ的比值明顯高于對(duì)照（P＜0.05），Th細(xì)胞向Th2偏移。詳見(jiàn)表4。

表4 各組血清IFN-γ、IL-4、IL-4／IFN-γ變化±s）

表4 各組血清IFN-γ、IL-4、IL-4／IFN-γ變化±s）

組別 n IFN-γ（pg／m L）IL-4（pg／m L） IL-4／IFN-γ對(duì)照組 10 85.83±5.83 16.93±2.62 0.20±0.03 5 d應(yīng)激組 10 65.32±13.261）18.52±3.45 0.30±0.051）10 d應(yīng)激組 10 60.29±8.722） 19.41±3.53 0.32±0.072）15 d應(yīng)激組 10 55.80±7.552） 21.07±5.08 0.36±0.012）與對(duì)照組比較，1）P＜0．05，2）P＜0.01。

3 討 論

近年來(lái)，有關(guān)心理應(yīng)激對(duì)機(jī)體行為和認(rèn)知功能障礙的研究越來(lái)越受到重視，持久過(guò)強(qiáng)的應(yīng)激可以通過(guò)多種途徑影響和改變中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能狀態(tài)，進(jìn)而引起動(dòng)物進(jìn)食情緒和行為的異常［3］。本實(shí)驗(yàn)顯示慢性應(yīng)激抑制了小鼠的體重增長(zhǎng)，與對(duì)照相比體重下降趨勢(shì)明顯，且隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，應(yīng)激組的體重始終較低。Open-fild實(shí)驗(yàn)是動(dòng)物在新異環(huán)境的探究、活動(dòng)、緊張、恐懼情緒和行為表現(xiàn)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)［4］，可衡量類(lèi)于人的復(fù)雜情緒如焦慮、抑郁等的。隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠自主活動(dòng)逐漸減少，中央格停留時(shí)間延長(zhǎng)；穿格次數(shù)呈遞減趨勢(shì)；糞便次數(shù)較正常組顯著增多，提示應(yīng)激使小鼠對(duì)周?chē)h(huán)境的探究能力減弱，有興趣減退、倦怠、食欲不振等行為，產(chǎn)生類(lèi)焦慮、抑郁等負(fù)性情緒效應(yīng)，行為情緒受到明顯抑制，且抑制的程度與應(yīng)激時(shí)間有關(guān)。

應(yīng)激能夠影響動(dòng)物和人體的免疫功能，胸腺和脾臟為機(jī)體主要免疫器官。腸黏膜淋巴結(jié)合有不同免疫細(xì)胞，是免疫應(yīng)答的啟動(dòng)位點(diǎn)，主要負(fù)責(zé)抗原的加工、處理及遞呈。應(yīng)激減輕小鼠脾臟重量，使體積縮小，脾臟指數(shù)與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而胸腺指數(shù)差異不明顯，考慮為增齡性的萎縮。脾淋巴細(xì)胞的數(shù)量和腸系膜淋巴結(jié)的細(xì)胞數(shù)量受到抑制，隨應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)呈明顯降低趨勢(shì)。慢性應(yīng)激抑制了小鼠的免疫功能。

T輔助細(xì)胞（Th）可分為T(mén)h0、Th1、Th2和Th3 4種亞群，其中Th1和Th2細(xì)胞及其細(xì)胞因子的激活決定了免疫系統(tǒng)的有效作用。Th1和Th2細(xì)胞可分泌不同的細(xì)胞因子，IFN-γ主要由Th1細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)細(xì)胞免疫，通過(guò)激活TC細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增強(qiáng)免疫功能［5］；細(xì)胞因子IL-4由Th2細(xì)胞分泌，促進(jìn)B細(xì)胞增殖、分化和產(chǎn)生抗體，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。本實(shí)驗(yàn)顯示各應(yīng)激組的Th1／Th2細(xì)胞失衡，IFN-γ的含量隨應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)逐步下降，顯著低于對(duì)照組，其他動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)［8］，應(yīng)激影響細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的能力并降低血中IFN-γ的水平，并且下降程度與應(yīng)激的程度成正比。細(xì)胞因子IL-4的含量雖有逐步上升趨勢(shì)。IFN-γ和IL-4是一對(duì)相互拮抗的因子，雖然IL-4的水平無(wú)顯著升高，但通過(guò)IFN-γ水平降低，仍導(dǎo)致Th1／Th2的失衡，從而導(dǎo)致機(jī)體的免疫功能降低。細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的應(yīng)答之外，還作為一種神經(jīng)遞質(zhì)，調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌和行為的改變［7，8］。慢性應(yīng)激如何使Th1／Th2細(xì)胞的漂移，逆轉(zhuǎn)或穩(wěn)定Th1／Th2狀態(tài)的藥物和方法是否可以改善情緒和行為，有待進(jìn)一步研究。

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