王宜芹 侯 曉 滕懷香

1.山東省日照市計劃生育科研所（276826）；2.山東省濟南市計劃生育服務中心

子宮內(nèi)膜增生癥是功能失調性子宮出血（簡稱功血）最常見的一種病理類型，屬異常子宮出血的范疇。是由于調節(jié)生殖的神經(jīng)內(nèi)分泌機制失調而引起的異常子宮出血，而全身及內(nèi)外生殖器并無器質性病變存在。本病的臨床表現(xiàn)有不規(guī)則的子宮出血，導致不同程度的貧血甚至休克。治療原則是止血，調整月經(jīng)周期或誘導閉經(jīng)改善全身癥狀。目前對功血的治療主要分為藥物治療和手術治療兩類［1］。近幾年米非司酮因其能拮抗雌孕激素，負面影響卵泡發(fā)育、延遲排卵，誘導黃體溶解，抑制子宮內(nèi)膜增生等作用被廣泛應用于功血的治療，尤其是圍絕經(jīng)期功血。本研究成功建立子宮內(nèi)膜增生癥的大鼠模型，通過觀察大鼠子宮內(nèi)膜組織中凋亡調控蛋白Fas／FasL的表達情況，從細胞凋亡角度進一步探討米非司酮治療功血的作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康成年SD雌性大鼠49只，體重220±20g，由山東大學實驗動物中心提供，合格證號SCXK（魯）20090001。

1.2 藥物與試劑

米非司酮片，北京紫竹藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號：1212088）；苯甲酸雌二醇注射液，寧波市三生藥業(yè)有限公司（批號：130101）；注射用青霉素鈉，山東省魯抗藥業(yè)股份有限公司（批號：L121018）；生理鹽水，山東威高藥業(yè)有限公司（批號：212100401）；10%水合氯醛，山東大學齊魯醫(yī)院（批號：20130502）；Fas免疫組化試劑盒、FasL免疫組化試劑盒均購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3 大鼠子宮內(nèi)膜增生模型制備

大鼠經(jīng)過適應性飼養(yǎng)1周后，隨機抽取15只作為正常組，另外34只均按照文獻［2］中“雌激素負荷法”進行造模。模型組僅行開關腹手術，其余大鼠均行手術摘除雙側卵巢，術后常規(guī)護理，肌注青霉素每次16×104U／ml，2次／d，共3d。術后第4天起肌內(nèi)注射經(jīng)稀釋的苯甲酸雌二醇15μg／100g，隔日一次，共4周。隨機抽取4只造模大鼠處死，取出子宮內(nèi)膜送病理檢測，經(jīng)證實為子宮內(nèi)膜增生癥表示造模成功，方可進行后續(xù)實驗。

1.4 動物分組、給藥及取材方法

將造模后的30只大鼠按照完全隨機法分為米非司酮組和模型組，每組15只，其中米非司酮組予以米非司酮混懸液灌胃，連續(xù)2周。正常組和模型組大鼠予等容量生理鹽水灌胃，日一次，連續(xù)2周。末次給藥后禁食12h，處死大鼠，摘取子宮，稱重后將標本放入4%多聚甲醛固定以備免疫組化實用。

1.5 指標檢測及結果判定

采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶連結法（S－P法）檢測指標Fas和FasL，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，免疫組織化學顯示，細胞漿或細胞核上有棕黃色顆粒沉著視為陽性反應。采用Image Plus Pro圖像處理分析系統(tǒng)，每例標本選取3張切片，每張切片均采用雙盲法隨機觀察5個不重復的高倍視野（×200），分別測量各組大鼠內(nèi)膜中陽性部位的灰度值。取其平均值，即代表各指標蛋白表達的相對量，以便半定量分析，灰度值越高蛋白表達水平越低，相反灰度值越低，蛋白表達水平越高。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料應用方差分析以ˉx±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠子宮重量及子宮系數(shù)比較

在造模前，49只大鼠的體重均在（220±20）g，組間比較無差異。造模后子宮重量明顯增加，模型組與正常組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。應用米非司酮干預后子宮重量有所減輕，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但仍較正常組明顯增加，組間比較差異顯著（P＜0.05）。子宮系數(shù)的變化與子宮濕重基本一致。見表1。

表1 各組大鼠子宮重量及子宮系數(shù)比較

表1 各組大鼠子宮重量及子宮系數(shù)比較

與正常組比較＊P＜0.05 ＊＊P＜0.01；與模型組比較＃P＜0.05＃ ＃P＜0.01；與米非司酮組比較▲P＜0.05

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2.2 各組大鼠子宮組織中Fas和FasL蛋白的表達

免疫組織化學顯示，F(xiàn)as蛋白主要位于間質細胞、腺上皮細胞的細胞漿內(nèi)，部分于細胞核上。FasL蛋白主要位于間質細胞、腺上皮細胞的細胞核。Fas蛋白在各組中表達的灰度值：正常組（116.63±16.94）＜米非司酮組（130.28±20.66）＜模型組（146.90±24.12），除米非司酮組與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義外，各組間差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。FasL蛋白在各組中表達的灰度值：模型組（122.77±28.10）＜米非司酮組（132.50±27.97）＜正常組（149.75±29.53），其中模型組與正常組比較灰度值明顯降低（P＜0.01），說明蛋白的表達較正常組高。米非司酮組與其他組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠子宮組織中Fas／FasL蛋白的表達（SP×200）

3 討論

功血是由下丘腦－垂體－卵巢軸功能失調引起而非生殖器器質性病灶或全身疾病所引起的不正常子宮出血癥，是常見的婦科疾病，屬中醫(yī)的“崩漏”范疇。功血發(fā)病機制復雜，至今尚未明了［3］。近年來，細胞凋亡與功血的關系受到許多專家及學者的重視，研究較多的凋亡調節(jié)蛋白有 Bcl－2／Bax、Fas／FasL、Survivin等［4］。Fas抗原屬于神經(jīng)生長因子／腫瘤壞死因子受體超家族的成員之一，F(xiàn)asL是Fas抗原的配體，屬于腫瘤壞死因子（TNF）家族，兩者結合可導致細胞調亡。Fas／FasL系統(tǒng)參與子宮內(nèi)膜增生過長的形成，F(xiàn)as及FasL蛋白在正常子宮內(nèi)膜中的生理性表達［5］，有利于維持細胞增殖和細胞凋亡平衡，在調節(jié)正常內(nèi)膜組織的增殖平衡與結構再建中起到至關重要的作用。功能正常時，F(xiàn)as蛋白通過誘導內(nèi)膜細胞凋亡而發(fā)揮抑制疾病發(fā)生的作用，一旦Fas信號失活會出現(xiàn)細胞凋亡下調、異常細胞生存繁殖，最終導致子宮內(nèi)膜增生癥的發(fā)生［6］。本研究在“雌激素負荷法”成功建立大鼠子宮內(nèi)膜增生癥模型基礎上，通過模型組與正常組中各指標的變化發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)as蛋白在子宮內(nèi)膜增生癥大鼠體內(nèi)的表達水平明顯低于正常大鼠。FasL蛋白的表達高于正常子宮內(nèi)膜，這一結果與國內(nèi)外學者的研究相一致。這也進一步說明了子宮內(nèi)膜增生癥中FasL蛋白表達增高和Fas蛋白的低表達，可導致局部細胞凋亡受到抑制，細胞增殖相對增多，影響了子宮內(nèi)膜的平衡與結構再建，最終促進了疾病的發(fā)生、發(fā)展［7］。

近幾年，米非司酮被廣泛應用于功血，尤其是絕經(jīng)過渡期功血的治療中。米非司酮在卵泡早期可直接抑制卵泡發(fā)育，在中期除直接作用于卵巢外，還能抑制卵泡刺激素和黃體生成素的分泌而抑制卵泡的發(fā)育，也可直接作用于卵泡顆粒細胞，促進其凋亡，增加閉鎖卵泡數(shù)，因此導致卵巢殘存卵泡衰萎，造成閉經(jīng)［8］。另外，米非司酮可使子宮內(nèi)膜腺上皮細胞出現(xiàn)明顯凋亡，抑制內(nèi)膜腺上皮增生［9］。同時米非司酮在對抗孕激素作用的同時也在某種程度上拮抗雌激素致子宮內(nèi)膜增生的作用，使基質致密度增加，子宮內(nèi)膜腺體減少，從而使子宮內(nèi)膜明顯變?。?0］。本研究中米非司酮組大鼠子宮重量及系數(shù)均較模型組明顯降低，F(xiàn)as蛋白的表達較模型組有明顯提高，這也進一步印證米非司酮有促進子宮內(nèi)膜增生細胞凋亡的作用，以上結論為將來深入研究功血的發(fā)病機制及治療措施提供了一個新的思路。由于條件限制，實驗未對相關指標進行完全定量分析，米非司酮對子宮內(nèi)膜的促凋亡機制尚待日后進一步系統(tǒng)的研究。

［1］ 周協(xié)和，方智淑.子宮內(nèi)膜增生的病理特點和臨床分析［J］.中國婦幼保健，2013，28（13）：2063－2064.

［2］ 賀豐杰，李小寧，張倩，等.凋膜止崩液對無排卵性功血大鼠子宮內(nèi) ERα及ER 表達的影響［J］.天津醫(yī)藥，2012，40（8）：793－795.

［3］ 史錦云，劉嘉茵.婦產(chǎn)科學［M］.南京：東南大學出版社，2000：212.

［4］ 王濱，鄭維國，辛曉燕，等.Fas／FasL系統(tǒng)在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達與意義［J］.山西醫(yī)科大學學報，2003，34：490－492.

［5］ 桑威.Fas／FasL系統(tǒng)參與的幾種生物學效應［J］.國際免疫學雜志，2006，11（9）：389－392.

［6］ IwaseM，Kondo G，WatanabeH，et al.Regulation of fas－mediated apoptosis in neutrophils after surgery induced acute inflammation［J］.J Surg Res，2006，134 （1）：114－123.

［7］ 李志凌，林虹，鄭燕鑾.子宮內(nèi)膜增生性疾病患者內(nèi)膜細胞凋亡的研究［J］.實用婦產(chǎn)科雜志，2003，19（1）：26－27.

［8］ 王振國.米非司酮配伍小劑量甲基睪丸素治療子宮內(nèi)膜非典型增生50例分析［J］.中國實用婦科與產(chǎn)科雜志，2007，18（4）：233.

［9］ 李燕雄，王忠彌.米非司酮在絕經(jīng)過渡期功能失調性子宮出血中的研究進展［J］.醫(yī)學綜述，2012，18（1）：144－145.

［10］ 葉選紅.米非司酮治療年期功能失調性子宮出血的臨床觀察.實用婦產(chǎn)科雜志，2006，20（3）：155.