曹晴+劉志東+代文兵+張強

[摘 要] 目的：建立高效液相色譜-四極桿串聯(lián)質譜聯(lián)用法 （ LC-MS/MS 法） 測定前列地爾注射液中前列腺素A₁的含量。方法：前列地爾注射液經稀釋后，采用Agilent.poroshell 120 SBC18色譜柱 （ 2.1×50 mm， 2.7 μm ） 進行分析，流動相為乙腈-0.5%甲酸水溶液，流速0.2 mL/ min；質譜采用電噴霧離子化 （ ESI ） 源，負離子-多反應監(jiān)測 （ MRM ） 模式，內標法定量。結果：前列腺素A₁的線性范圍為0.3～10 ng/mL ；平均回收率為100.2%，RSD為1.69%。3批樣品每 1 mL中含前列腺素A₁均未過 3.0 μg。結論：該方法準確、簡單、快速，可用于前列地爾注射液中前列腺素A₁的測定。

[關鍵詞] 前列地爾注射液；前列腺素A₁；液質聯(lián)用

中圖分類號：o657 文獻標識碼：A 文章編號：2055-5200（2014）01-060-04

Doi：10.11876/mimt201401016

Determination of Prostaglandin A₁ in Alprostadil injection by LC-MS/MS CAO Qing1， LIU Zhi-dong1， DAI Wen-bing2， ZHANG Qiang2. （1.Research Center of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193； 2.School of Pharmaceutical Sciences，Peking University， Beijing 100191）

[Abstract] Objective： To establish a liquid chromatography-tandem mass spectrometric method（LCMS /MS） for the determination of Prostaglandin A₁ in Alprostadil injection. Methods： After being diluted，the sample was separated on an Agilent.poroshell 120 SB-C18 column（2.1×50 mm 2.7 μm） for isocratic elution with a mobile phase of acetonitrile-0.5% formic acid water- solution at a flow rate of 0.2 mL/min.Then the processed sample was analyzed by tandem mass spectrometer with negativeelectrospray ionization（ESI） source，monitored under a multiple reaction monitoring（MRM） mode. Results： The calibration curve showed a good linearity in the range of 0.3 -10 ng/mL.The average recovery was 100.2% with RSD of 1.69%.The content of Prostaglandin A₁ in batches of Alprostadil injection samples was not more than 3.0 μg/mL. Conclusion： The developed method can be used for the quantitative determination of for Prostaglandin A₁ in Alprostadil injection.

[Key words] Alprostadil injection；compound；Prostaglandin A₁；LC-MS /MS

前列地爾是一種活性極強的內源性生理活性物質，具有明顯的擴張血管、抑制血小板聚集，從而抑制血栓素A2的釋放，它能特異性的作用于缺血局部，明顯擴張病變狹窄的血管。在動物和臨床研究中發(fā)現(xiàn)，該藥可以降低血液粘度紅細胞聚集性，改善血液流變學作用[1-2]。前列地爾在水溶液中化學穩(wěn)定性差，對光、熱、pH值敏感，前列地爾注射液在制備和儲存過程中主要降解雜質為前列腺素A₁[3-4]。在前列地爾注射液質量標準[5] 中前列腺素A₁的含量測定方法為固相萃取、柱后衍生化高效液相色譜法，方法較復雜。關于前列腺素A₁的 LC-MS/MS測定方法目前尚未見報道。本研究首次建立了 LC-MS/MS 法測定前列地爾注射液中前列腺素A₁含量的方法，注射液經稀釋后直接測定，操作簡便。測定了3批前列地爾注射液中前列腺素A₁的含量，結果準確。該方法可為今后簡單、方便地控制前列地爾注射液中前列腺素A₁的含量提供參考。

1 儀器與試藥

LC-20AD 型高效液相色譜儀（日本 Shimadzu 公司） ；API 4000 三重四極桿質譜儀（美國 AB Sciex公司） ，配有電噴霧離子源；BT25S 電子天平（Sartorius）。

乙腈、甲醇均為色譜純（德國 Merck 公司）；甲酸為色譜級（Formic Acid 99% HPLC，ROE scientific IAIC ，USA）；水為 Millipore 純化水。

前列腺素A₁ 標準品（批號051M1421V，純度≥98%，美國 Sigma 公司）、地塞米松標準品（純度>99%，美國 Sigma 公司）。前列地爾注射液（凱時，北京泰德制藥股份有限公司，規(guī)格：2 mL ： 10 μg）。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 標準儲備液 精密稱取前列腺素A₁標準品4 mg和內標地塞米松標準品10 mg，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成0.4 mg /mL的前列腺素A₁標準儲備液和1 mg /mL的內標地塞米松標準儲備液。

2.1.2 供試品溶液 精密量取前列地爾注射液50 μL和內標溶液 （5 μg /mL的地塞米松溶液） 200 μL置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按“2. 1. 2”項下方法制備不含前列地爾的陰性樣品。

2. 2 色譜-質譜條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent.poroshell 120 SBC18（2.1×50 mm ，2.7 μm）；流動相：乙腈（A）-0.5%甲酸水溶液（B）（50：50，V/V）[6]；流速：0.2 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：26 ℃。

2.2.2 質譜條件 ESI 源：負離子掃描； MRM 模式，定量分析的離子反應分別：m/z 335.0 → m/z 317.1（前列腺素A₁）和m/z 391.0 → m/z 361.2（地塞米松，內標）；碰撞氣壓力（CAD）： 6.0 psi； 氣簾氣壓力（CUR）：20 psi；霧化氣壓力（GS1） ： 40 psi； 去溶劑氣壓力（GS2） ： 50 psi； 去溶劑溫度（TEM） ： 500 ℃； 噴霧電壓（IS） ： -4500 V； 前列腺素A₁去簇電（DP） ： -34 V； 碰撞能（CE） ： -15 V；射入電壓（EP） ： -10 V； 碰撞室出口電壓（CXP） ： -6 V。地塞米松去簇電（DP） ： -90 V；碰撞能 （CE） ： - 14 V；射入電壓（EP） ： -10 V； 碰撞室出口電壓（CXP） ： -8 V。離子對駐留時間（Dwell） ： 100 ms。前列腺素A₁ 、地塞米松產物離子掃描質譜圖，見圖1。

在上述色譜-質譜條件下，流動相、對照品、陰性樣品與樣品圖譜見圖2。結果表明，前列地爾、輔料不干擾前列腺素A₁的測定，說明本LC-MS/MS條件下專屬性良好，見圖2。

2.3 線性關系

精密量取適量前列腺素A₁標準儲備液和內標溶液（5μg /mL的地塞米松溶液） 200μL，分別置于10mL容量瓶中，以甲醇-水（50：50，v/v）稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度分別為 0.3，0.5，1，2，5，10ng/mL的前列腺素A₁系列標準溶液，分別取 5μL進行LC-MS/MS分析，并記錄色譜圖和數(shù)據(jù)；以前列腺素A₁濃度值為橫坐標，以前列腺素A₁與內標的峰面積比值為縱坐標，用加權（W=1/x2）最小二乘法[7]回歸運算得到直線回歸方程，即為標準曲線：y=0.336x+0.00353 （r=0.9987）。前列腺素A₁在 0.3～10 ng/mL范圍內濃度與峰面積呈良好的線性關系。

2.4 精密度試驗

配制前列腺素A₁ 0.5、2、10 ng/mL 3個濃度的標準溶液，每個濃度平行3份，進樣分析，得相應峰面積，結果前列腺素A₁低、中、高3個濃度峰面積的RSD分別為1.63%、1.10%、1.61%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取樣品（批號2222M），依法制備供試品溶液，于制備好后 0、1、2、3、6 h 進樣分析，并隨行測定標準曲線，以標準曲線法計算前列腺素A₁的含量及其RSD，結果 RSD 為 3. 2%，表明供試品溶液在 0-6 h內穩(wěn)定。

2.6 重復性試驗

取樣品 （批號2222M），一式 6 份，依法制備溶液并進樣測定，隨行測定標準曲線，以標準曲線法計算前列腺素A₁的含量及其RSD，結果平均含量為0.68μg/mL，RSD 為2.3%，表明方法重復性良好。

2.7 加樣回收率試驗

精密量取陰性樣品（缺前列地爾） 50μL共9份，分別置10mL容量瓶中，分別加入適量前列腺素A₁標準溶液和內標溶液（5μg/mL的地塞米松溶液）200μL，然后用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制前列腺素A₁ 0.5、2、10ng/mL3個濃度的溶液，每個濃度平行3份，進樣分析，得相應峰面積，結果平均回收率為100.2%，RSD為1.69%（見表1）。

2. 8 基質效應

取陰性樣品 50μL，置10mL容量瓶中，分別精密加入適量前列腺素A₁ 對照品儲備溶液和內標溶液（5 μg/mL的地塞米松溶液） 200μL，然后用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度分別為 0.5、2、10ng/mL的前列腺素A₁溶液，進樣分析，得相應峰面積； 取相應3個濃度的標準系列溶液與內標混合后直接進樣分析，獲得待測物無基質影響的峰面積，用待測物每一濃度經過兩種處理方法所得的峰面積的比值計算本方法的基質效應。結果均在 90%～110%之間。表明在本方法下陰性樣品基質對前列腺素A₁的測定無影響。

2.9 樣品測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，每批樣品制備 3 份溶液，每份溶液進樣測定 1 次，并隨行測定標準曲線，以標準曲線法計算樣品中前列腺素A₁的含量，并計算每批樣品的平均含量，結果見表2。

3 討論

前列腺素A₁為前列地爾注射液在制備和儲存過程中主要降解雜質，已有文獻報道的測定前列腺素A₁的方法多為高效液相色譜法[8-11]， 樣品處理較為繁瑣， 測定較為費時。本文采用靈敏度高，專屬性強的高效液相色譜-四極桿串聯(lián)質譜聯(lián)用方法 （ LCMS/MS ） 測定，方法前處理簡單快速，樣品測定用時較短，靈敏度較高，檢測限低，并且重現(xiàn)性較好，結果可靠準確，適合于前列地爾注射液的前列腺素A₁控制。

參 考 文 獻

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