陸軍++++++祝進++++++徐禮鋒++++++白永鳳++++++余旭良

[摘要] 目的 對臨床分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）進行耐藥情況和分子流行病學監(jiān)測，探討院內MRSA的流行趨勢。方法 收集我院2009年1月～2011年6月臨床標本分離的MRSA菌株60株；采用 Microscan WalkAway 40進行菌株鑒定，同時對所有金黃色葡萄球菌進行藥物敏感性分析；采用脈沖場凝膠電泳技術對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌進行分子分型。結果 共收集60株MRSA菌株，其中17株被認為是可疑社區(qū)獲得（CA-MRSA），43株被認為是醫(yī)院獲得（HA-MRSA）。所有菌株均對萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺、呋喃妥因和奎奴普丁/達福普汀敏感，未出現耐藥菌株。CA-MRSA與HA-MRSA對左旋氧氟沙星和利福平的敏感性有明顯差異。臨床分離的MRSA菌株PFGE分型較為分散，共分為13種型別，每種型別的菌株數分別為2～6株不等，未出現大范圍的院內流行克隆。結論 本院收集的臨床分離的MRSA菌株多重耐藥性嚴重，其中CA-MRSA相對HA-MRSA敏感性稍高。所有金黃色葡萄球菌未出現糖肽類抗菌藥物耐藥。MRSA菌株未出現大范圍的院內流行株，但仍應加強院內感染流行控制。

[關鍵詞] 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；社區(qū)獲得性；醫(yī)院獲得性；藥物敏感性；脈沖場凝膠電泳

[中圖分類號] R378.1+1 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）07-0084-04

自20世紀60年代英國檢出世界上首例耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA），隨后各國MRSA發(fā)生率逐漸上升，至80年代后期MRSA已成為醫(yī)院院內感染的重要病原菌，占醫(yī)院分離的金黃色葡萄球菌的80%以上[1，2]。MRSA常對多種抗菌藥物呈現耐藥，并可通過接觸途徑進行傳播，從而引起傳播流行，故世界各國均將MRSA的流行情況作為長期監(jiān)測的重點[3，4]。我院于2009年底開始出現MRSA克隆株的流行，為了解MRSA分子流行克隆的耐藥性，探討本院耐甲氧西林金黃色葡萄球菌主要流行株及其分布特點，本研究對臨床非重復分離的60株MRSA進行分子分型，為院內感染的防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

2009年1月～2011年6月自衢州市人民醫(yī)院分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌60株，剔除重復菌株。所有菌株用濾紙片法-70℃保存。

1.2 試劑與儀器

西門子德靈公司MicroScan WalkAway-40全自動微生物鑒定儀進行鑒定，藥敏紙片選用英國OXOID公司產品，限制性內切酶ApaⅠ購自TaKaRa寶生物工程大連有限公司，溶葡萄球菌素、高密度瓊脂糖和低熔點瓊脂糖、溶菌酶、蛋白酶K購自生工生物（上海） 公司，Marker沙門菌Braendebrup血清型H9812由杭州邵逸夫醫(yī)院俞云松教授惠贈。CHEP-MAPPER 脈沖電泳儀、Universal HoodⅡ型凝膠成像儀均為BIO-RAD 公司產品，DK-8D型電熱恒溫水槽購自上海精宏公司，Rotamax 420搖床為Thermo公司產品。

1.3 分離鑒定及藥敏試驗

將從臨床采集的合格標本中分離的可疑菌落行革蘭染色、觸酶試驗、血漿凝固酶試驗，并用WalkAway-40全自動細菌鑒定儀鑒定并檢測各菌株對常用抗菌藥物的敏感性，同時用頭孢西丁紙片擴散法及苯唑西林MIC法篩選MRSA菌株。嚴格按照標準操作程序進行。判斷標準參照CLSI 2010年版；質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923和ATCC29213。

1.4 CA-MRSA的篩選

參照Fridkin等[5]建議依據臨床資料篩選CA-MRSA，即從門診或入院48h內分離收集的MRSA，且該患者近期無長期住院病史。符合上述條件的將被可疑為CA-MRSA臨床株。

1.5 MRSA臨床菌株的PFGE

參照文獻[6]，細菌的包埋；細胞壁的裂解；蛋白酶K消化；內切酶對細菌DNA的消化；加樣及電泳；凝膠成像儀下觀察結果，拍照。

1.6 PFGE條帶的解釋

通過目測判定其帶型之間的關系，采用Tenover 等[7]提出的標準進行分型。酶切圖譜間有同樣的條帶數，且相應條帶大小相同，可認為是同一型別；由于突變、插入、缺失或倒置的遺傳改變導致1～3條條帶有差異，可認為是緊密相關，定為亞型；帶型中4～6條條帶有差異為可能相關，可認為是不同型別；7個或更多個條帶有差異，可認為在流行病學上無相關性。

1.7 統(tǒng)計學方法

對CA-MRSA 組與HA-MRSA 組對抗菌藥物的敏感性進行統(tǒng)計學分析，采用χ2檢驗，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HA-MRSA和CA-MRSA對抗菌藥物的耐藥率

依據臨床資料對60株MRSA進行篩選，獲得17株疑似CA-MRSA（28.33%）及43株HA-MRSA（71.67%）。HA-MRSA和CA-MRSA對抗菌藥物的耐藥率比較詳見表1。

表1 CA-MRSA與HA-MRSA對抗菌藥物的耐藥率比較（%）

2.2 60株MRSA臨床分離株經PFGE分型

成功分型48株，型別共13種，命名從A型～M型（圖3），其中A型3種亞型共6株，B型2種亞型共5株，C型2株，D型2株，E型6株，F型4株，G型2種亞型共6株，H型2株，I型2種亞型共2株，J型5株，K型2株，L型3株，M型3株。這13種型別均有4條或4條以上電泳條帶不同，可認為無同源關系的散發(fā)克隆。同一型別菌株有不超過3條電泳條帶差異，可認為是同源克隆。部分PFGE結果見圖1。

圖1 MRSA部分臨床菌株PFGE電泳圖

1～13為MRSA臨床菌株，M為沙門菌Braendebrup血清型H9812endprint

從成功分型的48株MRSA菌株型別來看，這批菌株的同源分型較為分散，沒有典型的院內流行克隆株，相對較多的A型、E型、G型菌株數也只有6株，其他分型的菌株數均不超過6株。HA-MRSA菌株在每種型中均有出現，其中B型和G型的HA-MRSA菌株較多。CA-MRSA分布在7種型當中，其中A型出現3株，E型出現5株。

2.3 PFGE不同型別在3年時間內的變化趨勢

本研究收集MRSA菌株時間為2009年1月～2011年6月，期間每年分離到的MRSA菌株數逐年上升， 2009年分離12株，平均月分離菌株僅1株，2010年分離26株，平均月分離菌株達到2.2株，而2011年上半年就分離到22株，平均月分離菌株達到3.7株。PFGE的分型結果顯示，克隆分型數有逐年增多的趨勢，2009年出現5種分型，到2010年分型數就達到了9種， 2011上半年也已達到9種，那些新出現的分型應引起特別重視。B型和E型兩種分型3年時間均有出現，應加強對這種長期流行克隆的監(jiān)測工作。見圖2。

圖2 PFGE不同型別在3年時間內的變化趨勢

3 討論

MRSA已成為醫(yī)院感染的重要病原菌之一[8]，感染多見于有嚴重基礎疾病、免疫功能低下并使用侵入性操作和廣譜抗生素者[9]。本研究中， HA-MRSA占分離MRSA中的71.67%（43/60），說明院內感染仍是最主要的MRSA菌株來源，因此，為控制MRSA的院內感染，做好隔離、消毒措施，合理使用抗生素，嚴格執(zhí)行醫(yī)院感染控制制度是十分必要的[10]。Cepeda等[11]的研究早已證實，加強隔離等預防措施可有效切斷MRSA的傳播、降低其感染率。CA-MRSA占所有MRSA菌株的28.33%，高于章銳鋒等報道的15.3%[12]，低于溫洪偉等報道的42%[13]，這可能與地域性和患者來源有關。從藥敏結果分析，所有MRSA菌株對所有β內酰胺類抗生素高度耐藥，對大環(huán)內酯類、克林霉素類和四環(huán)素類等抗菌藥物的耐藥率>50.0%，而對萬古霉素、呋喃妥因、奎奴普汀/達福普汀、利奈唑胺和替考拉寧完全敏感。所以，萬古霉素仍是治療MRSA所致嚴重全身性感染的首選藥物，奎奴普汀/達福普汀、利奈唑胺和替考拉寧可作為萬古霉素治療效果欠佳時的備選藥物，而呋喃妥因目前僅用于治療下尿路感染性疾病。另外，我們還發(fā)現，在對左氧氟沙星和利福平的敏感性上兩組菌株有明顯差異，CA-MRSA的敏感性高于HA-MRSA，這與一些報道不完全相符，可能與不同地區(qū)存在不同的抗菌藥物的選擇壓力有關。

為了解感染源頭、傳播途徑以及克隆株中占主導地位的菌株類型，對懷疑MRSA流行株進行流行病學研究是十分必要且是遏制其爆發(fā)流行的關鍵，為此人們開發(fā)了很多種流行病學監(jiān)測的手段，目前MRSA分子流行病學監(jiān)測的方法主要有脈沖場凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）、金黃色葡萄球菌A 蛋白基因（spa）分型、葡萄球菌染色體mec耐藥盒（staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec）分型、多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）等[14]。PFGE 是建立在限制性內切酶多態(tài)性分析基礎上的分型技術，具有分辨率高、費用相對較低等特點，常用于短時間、小范圍的流行病學調查[15]。本研究所進行MRSA的分子流行病學調查范圍局限在醫(yī)院內，因此采用PFGE的方法可以清晰明確地反映院內菌株的流行克隆特點。PFGE分型電泳條帶相差1～3條，可認為是同一克隆型菌株。從PFGE分型的結果來看，院內分離60株MRSA沒有出現大規(guī)模的流行克隆，PFGE所分的型別較散，共有A型～M型13種，每種型別菌株數最多也僅為6株，有4種型別存在2種以上的亞型。HA-MRSA在各種型別上均有分布，沒有顯著性的差異，CA-MRSA由于菌株數較少而分布在7種型別，其中A型和E型菌株數較多，但沒有明顯集中趨勢。MRSA菌株的流行在院內有逐年增多的趨勢，在所有分離到的60株MRSA菌株中，2009年分離12株，平均月分離菌株僅1株，2010年分離26株，平均月分離菌株達到2.2株，而2011年上半年就分離到22株，平均月分離菌株達到3.7株。PFGE的分型結果顯示，克隆分型數也有逐年增多的趨勢，對一些長期出現的同源克隆分型，應加強監(jiān)測，采取切實可行的院感控制工作。

MRSA很有可能通過醫(yī)護工作人員的手及鼻腔傳播給患者，或者在使用侵入性醫(yī)療器械時發(fā)生交叉感染。因此，加強醫(yī)護人員的感染控制觀念，利用精確、可靠且分辨率強的分型技術加強MRSA感染監(jiān)控至關重要。

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（收稿日期：2013-11-11）endprint

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