布冠好，朱婷偉，陳復生，張 楠，劉昆侖，張麗芬

（河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

0 引言

大豆和大豆副產(chǎn)品因為其較高的營養(yǎng)價值和良好的物理化學性質(zhì)，被廣泛應用于食品和飼料工業(yè)中.然而，大豆蛋白長期以來也被認為是食物過敏原之一.此外，由于大豆蛋白過敏原可能在幼齡動物及人體內(nèi)引起潛在的過敏反應，隨著大豆蛋白產(chǎn)品在食品工業(yè)中使用量的增加，大豆蛋白致敏性的研究也越來越多[1].在大豆中，至少檢測到21 種致敏蛋白，大豆球蛋白（Glycinin）是其中之一，它已被確定為主要的大豆變應原[2].大豆球蛋白是由酸性（A1a、A1b、A2、A3、A4、A5）和堿性（B1a、B1b、B2、B3、B4）多肽鏈通過二硫鍵連接組成，其中每條酸性鏈和堿性鏈的分子質(zhì)量分別為34～44 ku和20 ku[3]，它為11S 的主要成分，占總大豆蛋白的19.5%～23.1%，分子質(zhì)量為300～380 ku[4].據(jù)報道，大豆球蛋白過敏反應會產(chǎn)生腹瀉、腸道損害、免疫功能紊亂等現(xiàn)象[5]，而免疫反應的嚴重程度取決于大豆球蛋白的劑量.

過敏原在食物制品中的檢測是非常困難的，因為變應原通常是很微量的，且可以由食物基質(zhì)屏蔽[1].大豆球蛋白的定量測定可以通過高效液相色譜法進行[4]，但該方法耗時，且需要昂貴的設備.免疫分析方法因其操作簡單、廉價、處理樣品量大等優(yōu)點已經(jīng)被廣泛應用.其中，酶免疫法（ELISA）現(xiàn)已應用于牛乳蛋白、大豆蛋白的快速檢測分析中[6].布冠好等[7]已建立了測定牛乳球蛋白的間接競爭ELISA 方法.Liu 等[8]建立了競爭ELISA 方法來檢測大豆中β-伴大豆球蛋白的α 亞基，得到的方法靈敏度較高.Cucu 等[9]基于競爭ELISA 法來測定食物中大豆過敏原蛋白.本研究意在建立一種間接競爭ELISA 法用于檢測大豆中主要過敏原大豆球蛋白，為低敏性大豆制品的開發(fā)提供檢測方法.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大豆球蛋白（Glycinin，G3171），β-conglycinin（C5868），酶標二抗（HRP 標記的羊抗兔IgG，A6154），弗氏完全佐劑和弗式不完全佐劑：Sigma公司；新西蘭大白兔：鄭州大學實驗動物中心提供；兔抗Glycinin 血清（自制）；牛血清蛋白（BSA），TMB 單組份顯色液：北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純.

1.2 儀器與設備

96 孔酶標板：Corning Costar 公司；FC 型酶標儀：賽默飛世爾儀器有限公司；LRH-150F 型恒溫生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司.

1.3 試驗方法

1.3.1 兔抗大豆球蛋白多克隆抗體的制備[10]

選取2 只成年健康雄性新西蘭大白兔，平均體質(zhì)量2.5 kg，隨機編號，飼養(yǎng)于鄭州大學實驗動物中心.喂養(yǎng)3 d 后，觀察無異樣，即進行免疫處理.將免疫抗原大豆球蛋白（Glycinin）分別用無菌去離子水稀釋至濃度為1 mg/mL，分裝，-20 ℃保存；第1 次免疫前耳緣靜脈采血，收集陰性對照血清；免疫時每次取合適劑量的抗原用無菌去離子水稀釋至600 μL，再與等體積的弗氏完全或不完全佐劑充分乳化后，頸背部皮下多點注射成年雄性家兔，免疫6 次.第1 次取抗原300 μL 與等量弗氏完全佐劑充分乳化后，頸背部皮下多點注射；第2～5 次，每隔10 d 進行一次免疫，每次取200 μL 抗原與等量弗氏不完全佐劑充分乳化后，頸背部皮下多點注射；最后一次不含佐劑加倍的抗原耳緣靜脈注射，3 d 后心臟采血，收集血清、分裝后-20 ℃保存.5 免后第7 天耳緣靜脈采血，分離血清，由間接ELISA 方法檢測多抗血清效價.然后第6 次免疫，3 d 后大量采血，先于37 ℃放置1 h，然后于4 ℃放置過夜，使血清充分析出，以3 000 r/min 離心10 min，分離血清，用小管分裝后于-20℃保存.

1.3.2 間接競爭ELISA 方法的建立

1.3.2.1 間接ELISA程序[7]

包被抗原：以一定質(zhì)量濃度的抗原包被96 孔酶標板，每孔100 μL，4 ℃過夜.次日傾去孔內(nèi)液體，PBST（pH 7.4，0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液，0.05%Tween-20）洗滌4 次，每孔250 μL，每次3 min，然后用吸水紙拍干，用封閉液（pH 7.4，0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液，1% BSA，0.1% Tween-20）進行封閉，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h；之后，PBST 洗滌4次，拍干.抗原抗體反應：加入系列稀釋的被測抗原和一定稀釋度的抗血清1∶1 進行預混合，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，PBST 洗滌4 次，拍干；加入一定稀釋度的酶標二抗，37 ℃孵育1 h，PBST 洗滌4 次，拍干；加入TMB 單組分顯色液，每孔100 μL，37 ℃顯色10 min 后，每孔加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應.利用酶標儀雙波長測定各孔的OD 值，實際OD 值=OD450-OD620.

1.3.2.2 抗血清工作濃度和抗原最佳包被濃度的確定

利用方陣滴定法，將抗原Glycinin 用包被液（pH 9.6，50 mmol/L 碳酸鹽緩沖液）稀釋為0.1、0.05、0.025、0.012 5 μg/mL，每行一個稀釋度加入到酶標板中，4 ℃過夜.抗血清用封閉液稀釋成1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600、1∶51 200，每列一個稀釋度加入到酶標板中，37 ℃孵育1 h.然后按照1.3.2.1 的步驟進行OD 值的測定，選擇OD 值在1.0 左右的抗原和抗血清濃度為最佳工作濃度.

1.3.2.3 酶標二抗稀釋度的選擇

在優(yōu)化出的最佳抗原包被濃度和最佳抗血清稀釋度下，將酶標二抗用封閉液稀釋為1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000，每行一個稀釋度，每孔100 μL，分別加入到酶標孔中.然后按照1.3.2.1 的步驟進行OD 值的測定，選擇OD 值在

1.0 左右的酶標二抗?jié)舛葹樽罴压ぷ鳚舛?

1.3.2.4 抗原最佳包被時間的確定

以最佳的抗原包被濃度包被酶標板，分別在4℃過夜，37 ℃孵育2 h 后4 ℃過夜，37 ℃孵育2 h，37 ℃孵育4 h 條件下放置，抗血清和酶標二抗?jié)舛染鶠樽罴压ぷ鳚舛?，然后按?.3.2.1 的步驟進行OD 值的測定，確定最佳的抗原包被時間.

1.3.2.5 抗原抗體最佳反應條件的選擇

用最佳抗原濃度和最適包被條件來包被酶標板，并選擇最佳的抗血清和酶標二抗稀釋度加入，抗原抗體分別在37 ℃和25 ℃下反應0.5、1、2 h，測定OD 值來確定最佳的抗原抗體反應條件.

1.3.2.6 底物最佳反應條件的確定

在其他條件為最佳條件的情況下，底物顯色反應分別在37 ℃溫育5、10、20 min 及25 ℃溫育5、10、20 min 進行，然后按照1.3.2.1 步驟，測定各組OD 值以確定最佳底物反應條件.

1.3.2.7 標準曲線的建立

將Glycinin 用包被液分別稀釋成0.001～0.1 μg/mL 的濃度系列，在上述步驟得到的最佳條件下，進行間接競爭ELISA 測定.最后將Glycinin 各濃度對應的OD 值轉(zhuǎn)換成（B/B0）%值為縱坐標，并以對應的Glycinin 濃度的常用對數(shù)值為橫坐標，制作標準曲線.其中，B 為Glycinin 競爭時各對應濃度的OD 測量值，B0為無抑制時的OD 值.

選擇標準曲線上呈明顯相關區(qū)段的（B/B0）%和lg[Glycinin]，根據(jù)公式Logit（（B/B0）%）=ln（B/（B0-B）），計算各標準點的Logit（（B/B0）%），最后做對應于lg[Glycinin]的Logit（（B/B0）%）的回歸分析，得出線性回歸方程及相關系數(shù).

1.3.2.8 方法的精密度

對建立ELISA 檢測方法進行精密度測試，分別以板內(nèi)變異系數(shù)和板間變異系數(shù)表示.板內(nèi)誤差：每一個樣品濃度做4 次重復，計算標準差，以板內(nèi)變異系數(shù)（CV）表示板內(nèi)誤差.板間誤差：在不同的酶標板上分別做3 次重復，測定OD 值，計算出各濃度的標準差及變異系數(shù)，以板間變異系數(shù)表示板間誤差.

1.3.2.9 抗體特異性鑒定[11]

將兔抗Glycinin 抗體與大豆蛋白中的伴大豆球蛋白（β-conglycinin）進行免疫交叉試驗.

2 結果與討論

2.1 抗血清效價的測定

在免疫過程中對兔子進行定期采血，對抗血清的效價進行檢測，并對抗體特異性進行考察，以此為依據(jù)選擇較好的抗體進行下一步的試驗.由ELISA 方法測定兔抗Glycinin 血清的最高效價均達到了1∶10 000，所制備的抗血清效價較高[12]，可用于下一步的酶聯(lián)免疫試驗.

2.2 間接競爭ELISA 最佳條件的確定

2.2.1 抗血清最佳稀釋度和抗原最佳包被濃度

建立ELISA 方法時，應對包被抗原及抗體的濃度進行優(yōu)化，以達到最適合的測定條件，并且節(jié)省測定的費用.采用方陣滴定法來確定抗原最適包被濃度和抗血清最佳稀釋度，結果如表1 所示.

表1 Glycinin 包被抗原和抗血清工作濃度的確定

當包被抗原Glycinin 的最佳包被濃度為0.025 μg/mL、對應的抗血清最適稀釋倍數(shù)為1∶3 200 時，測定的OD 值在1.0 左右，說明Glycinin 抗原、抗體最佳工作條件分別為0.025 μg/mL 和1∶3 200.

2.2.2 酶標二抗最適工作濃度

在ELISA 方法中，酶標記物濃度的變化會對試驗結果產(chǎn)生很大的影響.濃度過高，可使非特異性反應增加，濃度過低又影響測定結果的敏感性[12].試驗中將HRP-羊抗兔IgG 做不同的稀釋度，結果如表2 所示.

表2 HRP-羊抗兔IgG 最適工作濃度的確定

從表2 可以看出，隨著稀釋度的增大，OD 值逐漸減??；當酶標二抗以1:10 000 稀釋時，測定的OD 值接近1.0，為酶標二抗的最佳工作稀釋度.

2.2.3 抗原最適包被條件

將抗原固相化的過程稱為包被.試驗中，在不同條件下包被抗原結果如表3 所示.

表3 抗原包被條件的確定

由表3 可知，37 ℃包被2 h、4 h 及37 ℃溫育2 h 過夜所測得的OD 值結果偏小，且所需時間較長；而4 ℃過夜包被抗原條件下所測得的OD 值在1.0 左右，為本試驗得到的抗原包被的最佳條件.

2.2.4 抗原抗體最佳競爭反應條件

抗原抗體進行結合需要一定的時間和溫度，此時反應的時間應嚴格控制.保溫容器最好可使溫度迅速平衡[13].本試驗采用恒溫箱，將酶標板置于底部墊有紗布的帶蓋金屬濕盒中，放于恒溫箱中進行反應.不同溫度不同時間下抗原抗體反應測定結果見表4.

表4 抗原抗體反應溫度和時間確定

從表4 可以看出，抗原抗體反應的最佳條件為37 ℃、1 h，此時，測定的OD 值接近1.0.

2.2.5 底物最佳反應條件

在ELISA 方法中，辣根過氧化物（HRP）為最常用的酶，它具有價格低廉和性質(zhì)比較穩(wěn)定的特點.本試驗采用TMB 作為HRP 的底物，TMB 經(jīng)HRP 作用后產(chǎn)物顯藍色，從而探究底物反應條件對顯色反應的影響，結果見表5.

表5 底物反應溫度和時間的確定

由表5 可知，在一定的溫度下隨著反應時間的增加，OD 值逐漸增大，在37 ℃溫育10 min 時OD 值在1.0 左右，37 ℃反應10 min 之前，OD 值偏小，說明顯色不完全.25 ℃下反應測得的OD 值均偏小.綜合考慮選擇37 ℃反應10 min 作為底物的最佳反應條件.

2.2.6 標準曲線的制作

將Glycinin 標 準 品 按0.001、0.01、0.012 5、0.015、0.02、0.025、0.03、0.04、0.05、0.1 μg/mL 稀釋，在確定的大豆蛋白Glycinin 間接競爭ELISA 最佳試驗條件下進行測定，以Glycinin 濃度的常用對數(shù)為橫坐標，以抑制率（B/B0）%為縱坐標繪制得到標準曲線如圖1 所示.

圖1 Glycinin 間接競爭ELISA 法的標準曲線

由圖1 可以得出，在0.01～0.05 μg/mL 范圍內(nèi)，標準曲線線性關系良好且曲線斜率也較大，故選取該區(qū)域進行回歸直線方程擬合.線性回歸轉(zhuǎn)換后的回歸分析結果見圖2.

圖2 Logit 回歸的線性擬合曲線

在圖2 中，回歸方程中y 為Logit（（B/B0）%），x 為lg[Glycinin]，擬合的線性回歸直線方程為y=-2.433 7x-4.677 7，相關系數(shù)R2=0.991 1，符合線性關系的判定標準.故最佳檢測范圍為0.01～0.05 μg/mL.

2.2.7 方法的精密度

Glycinin 間接競爭ELISA 精密度的測定結果如表6 所示.

表6 間接競爭ELISA 標準曲線的板內(nèi)誤差和板間誤差

板內(nèi)誤差以標準曲線的板內(nèi)平均變異系數(shù)（CV）來表示，其中，CV=SD 均值/平均孔間結合率×100%=1.46/38.24×100%=3.82%.

板間誤差以3 次測定平均的板間變異系數(shù)（CV）表示，由表6 可得，各濃度的板間變異系數(shù)在6.31%～12.52%，平均為10.22%.ELISA 方法板內(nèi)變異系數(shù)一般要求要低于10%，板間變異系數(shù)的允許值一般要求低于15%[12]，故由板內(nèi)誤差和板間誤差可知，本試驗方法重復性較好.

2.2.8 交叉反應

兔抗Glycinin 抗體的特異性檢測結果如圖3所示.

圖3 兔抗Glycinin 抗體和β-conglycinin 的免疫交叉曲線

從圖3 可以看出，Glycinin 在某一區(qū)域出現(xiàn)下降趨勢，而β-conglycinin 的（B/B0）%值基本不受濃度的影響，曲線趨勢始終保持平穩(wěn).這說明βconglycinin 與所制備的Glycinin 抗體之間不存在免疫交叉現(xiàn)象，Glycinin抗體特異性良好.

3 結論

本研究首先成功制備了兔抗Glycinin的多克隆抗體，并在此基礎上對間接競爭ELISA 法的條件進行摸索，確定了最佳的反應條件為：抗原Glycinin 最佳包被濃度為0.025 μg/mL，包被4 ℃過夜，抗血清的最適稀釋度為1∶3 200，抗原抗體最佳反應條件37 ℃孵育1 h，酶標二抗的最佳稀釋度為1 ∶10 000.擬合線性回歸直線方程為y=-2.433 7x-4.677 7，相關系數(shù)R2=0.991 1，其檢測的線性范圍為0.01～0.05 μg/mL，檢測的板內(nèi)誤差3.82%，板間誤差10.22%.結果表明該方法具有一定的重復性和靈敏度，并且操作較為簡單.大豆蛋白中Glycinin 抗原的間接ELISA 檢測方法的建立，為大豆過敏原及低敏性大豆蛋白產(chǎn)品的開發(fā)提供了有效的檢測手段.

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