尹 燕，黃相中，關(guān)小麗，李艷春，倪 崛，李云龍

(1.云南瑞寶生物科技有限公司，云南 昆明 650217; 2. 云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

梔子是茜草科植物梔子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果實(shí)，為臨床常用中藥，屬衛(wèi)生部頒布的第一批藥食兩用資源，其性寒、味苦，歸心、肺、三焦經(jīng)[1].在我國主要分布于江蘇、安徽、江西、廣東、廣西、云南、河南、貴州、四川、湖北、福建、臺(tái)灣等地[2].梔子苷是梔子的主要成分之一，梔子藍(lán)色素是以梔子苷為底物，經(jīng)過β-葡萄糖苷酶的作用或微生物發(fā)酵所制得的天然色素[3-5]，梔子藍(lán)色素的穩(wěn)定性已有文獻(xiàn)報(bào)道[6-8]，抗氧化活性未見報(bào)道.本研究用米曲霉發(fā)酵產(chǎn)物水解梔子苷，水解產(chǎn)物與味精反應(yīng)制備梔子藍(lán)色素，旨在提高梔子藍(lán)色素粗品的色價(jià)，并用大孔樹脂DM-2對制得的梔子藍(lán)色素進(jìn)行精制，同時(shí)以DPPH自由基捕獲分光光度法測定梔子藍(lán)色素的抗氧化活性，為提高梔子藍(lán)色素工業(yè)化生產(chǎn)中粗品的色價(jià)提供科學(xué)依據(jù)，為食用天然色素的應(yīng)用進(jìn)一步拓寬渠道.

1 材料與方法

1.1 材料

1) 原料與試劑.梔子苷(液態(tài)，含量42.30%)，云南瑞寶生物科技有限公司；米曲霉(編號：ym3 051)，云南省微生物研究所；1,1-二苯-2-苦肼基(DPPH·)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，Sigma 公司；DM-2大孔吸附樹脂，山東魯抗立科藥物化學(xué)有限公司；味精(含量≥99%)，河南蓮花味精股份有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)，生物試劑，北京三藥科技開發(fā)公司；水為蒸餾水；其它試劑均為國產(chǎn)分析純.

2) 儀器與設(shè)備.KY-隔水式培養(yǎng)箱， BS-2F恒溫震蕩培養(yǎng)搖床，金壇市華城開元實(shí)驗(yàn)儀器廠；LDZX-BOA立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái)，中日合資蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；FA1604 型電子天平，上海天平儀器廠； ZK-82A真空干燥箱，上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市華富儀器有限公司；UV 1810分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PDA培養(yǎng)基的配制

取3.7 g培養(yǎng)基粉末，加水100 mL，加熱溶解，分裝于15 mm×150 mm的試管中，加塞、包扎，121 ℃滅菌20 min后取出試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆?

1.2.2 發(fā)酵液的制備

1) 菌懸液的制備.在無菌的條件下，把米曲霉接入PDA培養(yǎng)基，在29 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)73 h，然后用無菌生理鹽水配制成107～108cfu·mL-1的菌懸液.

2) DNS試劑的配制.準(zhǔn)確稱取無水的3,5 -二硝基水楊酸3.25 g，氫氧化鈉1.6 g溶解于20 mL蒸餾水中，加入22.5 mL丙三醇溶解定容至500 mL，貯存于棕色試劑瓶中.

3) 培養(yǎng)基的優(yōu)化.選擇麥麩(A)、(NH4)2SO4(B)、CaCl2(C)、ZnSO4·7H2O(D)、MgSO4·7H2O(E)、KH2PO4(F)因素，4水平對液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，因素水平變化(見表1).固定菌懸液的接入量為3%，發(fā)酵溫度為30 ℃，搖床的震蕩速率為130～150 r/min，發(fā)酵時(shí)間為84 h.參照文獻(xiàn)[9-10]，分別取1 mL 發(fā)酵液于10 mL比色管中，加入1 mL 0.5%水楊素(溶于pH 4.6, 0. mol/L HAc 緩沖溶液)，在50 ℃下水浴保溫30 min后，加入 1.5 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻至室溫后用蒸餾水定容，在540 nm處測定吸光值.

4) 發(fā)酵條件的優(yōu)化.通過正交試驗(yàn)，選擇溫度(A)、搖床的震蕩速率(B)、裝液量(E)、接種量(D)及發(fā)酵時(shí)間(C)5因素，4水平進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，因素水平變化(見表2).

表1 液體發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)因素水平變化 %

表2 液體發(fā)酵條件正交試驗(yàn)因素水平變化

1.2.3 梔子藍(lán)色素制備條件的優(yōu)化

選擇梔子苷的質(zhì)量濃度(D)、裝液量(B)、震蕩速率(A)、加味精前的反應(yīng)時(shí)間(C)4因素3水平進(jìn)行正交試驗(yàn)對梔子藍(lán)色素的制備條件進(jìn)行優(yōu)化，因素變化見表3.參照文獻(xiàn)[5,11-12]，反應(yīng)溫度為 50 ℃，味精的添加量為梔子苷質(zhì)量的0.7倍，加發(fā)酵液水解時(shí)間為6 h，發(fā)酵液的添加量 ∶梔子苷的質(zhì)量為2(V∶m).通過反應(yīng)液中梔子藍(lán)的色價(jià)與反應(yīng)所需梔子苷的濃度比值對正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析.

表3 梔子藍(lán)制備條件正交試驗(yàn)因素水平變化

1.2.4 梔子藍(lán)色素的精制

稱取16份10.64 g梔子苷于4個(gè)500 mL三角瓶中，分別加水稀釋到140 g，每瓶中加入1.2.2中的發(fā)酵液9.8 mL，在50 ℃的恒溫?fù)u床內(nèi)，160～180 r/min的震蕩速率下反應(yīng)6 h,各加入3.15 g味精，繼續(xù)反應(yīng)40 h，取出放入80 ℃的恒溫水浴中30 min，反應(yīng)液合并過濾，得 2 321.5 g濾液，取其中220.00 g在60 ℃和60～70 kPa真空度下濃縮，60～70 ℃和60～70 kPa真空度下干燥得到10.72 g梔子藍(lán)色素A(精品).向32 mm×400 mm的層析柱中加入處理好的200 mL DM-2大孔樹脂，加入350.0 g梔子藍(lán)濾液，先用400 mL水洗脫，然后用300 mL 65%的乙醇溶液進(jìn)行脫液.65%的乙醇洗脫液減壓濃縮、干燥得精制梔子藍(lán)色素8.10 g，在594.0 nm處測定梔子藍(lán)色素的吸光度.

(1)

1.2.5 梔子藍(lán)色素清除DPPH·能力的測試

參照文獻(xiàn)[13]，分別取3.0 mL不同質(zhì)量濃度的梔子藍(lán)色素的30%乙醇溶液，與5.0 mL 0.065 mmol/L DPPH·的50%乙醇溶液均勻混合，避光放置20 min，在517 nm處測定其吸光度的變化，以BHT為陽性對照，DPPH·清除率(Kp) 計(jì)算方法如下：

Kp=[1-(As-Ar)/A0]×100% .

As為加樣品溶液時(shí)的吸光度，A0為用30%乙醇替代樣品溶液時(shí)的吸光度,Ar為用50%乙醇替代DPPH·溶液時(shí)的吸光度，重復(fù)測定3次，取其算術(shù)平均值.

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液制備條件的優(yōu)化

2.1.1 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

液體發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)分析結(jié)果見表4～5.由表4～5可以得出，極差值R的大小為麥麩(A)> (NH4)2SO4(B)和KH2PO4(F)>MgSO4·7H2O(E)>CaCl2(C)>ZnSO4·7H2O(D)，最佳配方為3%麥麩，0.3%(NH4)2SO4，0.02% CaCl2，0.6%KH2PO4，0.01 %MgSO4·7H2O，0.01 %ZnSO4·7H2O.以此條件做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測得吸光值為0.476，進(jìn)一步證實(shí)該配方為最優(yōu)配方.

表4 液體發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)L16(46)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

表5 液體發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗(yàn)L16(46)極差分析

2.1.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

發(fā)酵條件正交試驗(yàn)分析結(jié)果見表6～7.由表6～7可知，極差值R的大小為裝液量(E)>震蕩速度(B)>溫度(A)>發(fā)酵時(shí)間(C)>接種量(D).最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30℃，震蕩速率130～150 r/min，裝液量為30 mL，接種量3%，發(fā)酵時(shí)間96 h.以此條件做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測得吸光值為0.511，進(jìn)一步證實(shí)該發(fā)酵條件為最優(yōu)條件.

2.2 梔子藍(lán)色素制備條件的優(yōu)化

梔子藍(lán)制備條件正交試驗(yàn)分析結(jié)果見表8～9.由表8～9可知，極差值R的大小為震蕩速率(A)>加液量(B)>味精的反應(yīng)時(shí)間(C)>梔子苷的質(zhì)量濃度(D).最佳條件為震蕩速率160～180 r/min，加液量為30%，味精反應(yīng)時(shí)間40 h，梔子苷濃度3%，以此條件做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，梔子藍(lán)的色價(jià)與反應(yīng)所需梔子苷的濃度的比值為150.10，進(jìn)一步證實(shí)該制備條件為最優(yōu)條件.

表6 液體發(fā)酵條件正交試驗(yàn)L16(45)分析結(jié)果

表7 液體發(fā)酵條件正交試驗(yàn)L16(45)極差分析

表8 梔子藍(lán)色制備條件正交試驗(yàn)L9(34)分析結(jié)果

表9 梔子藍(lán)色制備條件正交試驗(yàn)L9(34)極差分析

2.3 發(fā)酵液添加量對梔子藍(lán)色素生成的影響

按上述制備條件對發(fā)酵液的添加量進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)酵液添加量對梔子藍(lán)色素生成的影響(見圖1).由圖1可知，發(fā)酵液的最優(yōu)添加量為0.07mL/g.

2.4 梔子藍(lán)色素的精制

采用DM-2大孔樹脂層析柱對梔子藍(lán)色素粗品進(jìn)行精制.精制前梔子藍(lán)色素粗品的色價(jià)為90.56，經(jīng)過大孔樹脂精制后，梔子藍(lán)色素的色價(jià)提高到180.01，得率為90.96%.

2.5 梔子藍(lán)色素清除DPPH·能力

DPPH·是一種人工合成的穩(wěn)定自由基，分子結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)苯環(huán)，1個(gè)N原子上有1個(gè)孤對電子，其乙醇溶液呈紫色，經(jīng)波長掃描，體系的最大吸收波長在517 nm處，因此，實(shí)驗(yàn)選擇517 nm為測定波長.按照1.2.5的測定方法，測得在波長517 nm 處的吸光度越小，樣品清除DPPH·能力越強(qiáng)，樣品的抗氧化能力越強(qiáng).因而測定試樣對DPPH·清除率可用于簡便、準(zhǔn)確地評價(jià)其抗氧化能力.圖2是DPPH·法測定梔子藍(lán)色素的抗氧化能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果.圖2表明，梔子藍(lán)色素粗品A及精制品B對DPPH·具有較好的清除能力，清除率隨樣品濃度的增加而增大，且梔子藍(lán)色素精制品B的DPPH·清除能力比梔子藍(lán)色素粗品A的強(qiáng)(梔子藍(lán)色素A和B的EC50分別為43.5 μg·mL-1和37.5 μg·mL-1).

3 結(jié)語

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