賴毛華， 馬紅霞， 鄭艷華， 宋興華， 劉 華(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 廣東 廣州 510120)

多囊卵巢綜合征是育齡期婦女常見的生殖內(nèi)分泌及代謝紊亂性疾病，其病因不清，具體發(fā)病機制不明，同時至今沒有最佳治療方案，因此建立一種理想的PCOS動物模型非常重要，由于大鼠有規(guī)律的動情周期，且周期較短(4-5 d)，容易在較短時間觀察到更多的生殖周期，因而成為較理想PCOS造模動物[1]?，F(xiàn)代研究認為高雄激素血癥和胰島素抵抗是PCOS的主要內(nèi)分泌特征，二者相互促進，惡性循環(huán)，參與了PCOS的病理過程，為進一步探索治療PCOS的方案，本文采用丙酸睪丸酮及高脂飼料誘導(dǎo)雌性SD大鼠PCOS 動物模型，并分析其胰島素抵抗(insulinresistance，IR)特征，旨在尋找一種符合人IR 特征的PCOS 研究模型。

1 實驗資料與方法

1.1 實驗動物及動物模型構(gòu)建 選取21 日齡的SD雌性大鼠，隨機分成模型組與對照組，每組各10 只。 模型組大鼠斷奶后于第22 日齡起喂高脂飼料喂養(yǎng)(成分為54%的普通顆粒飼料、17%豬油、15%糖、9%酪蛋白、1%礦物質(zhì)、1%維生素、3%麥芽糊精，由廣東省實驗動物中心加工完成)，并每天皮下注射含丙酸睪丸酮的油劑(將1 g丙酸睪丸粉末溶解于100 mL注射用無菌大豆油中，配成10 mg/mL的油劑)，以1 mg/100 g體重劑量注射，連續(xù)8周。對照組每天給予普通飼料喂養(yǎng)，并每天皮下注射注射等劑量的大豆油劑，連續(xù)8周。

1.2 試劑 丙酸睪丸酮(美國sigma公司)；卵泡刺激素放免試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)；雌二醇放免試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)；睪酮放免試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)；胰島素放免試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)；促黃體生成素ELISA試劑盒(美國R&D公司)；促卵泡生成素ELISA試劑盒(美國R&D公司)；羅氏活力型血糖儀(德國羅氏診斷有限公司)。

1.3 性激素檢測 口服糖耐量檢測結(jié)束后第3天，18：00開始禁食，次日晨以10%水合氯醛(6 mL/kg)腹腔注射麻醉后，眶靜脈采血4～7 mL，離心后收集血清，-20℃凍存，以放射免疫法檢測睪酮和雌二醇，ELISA法檢測FSH和LH。

1.4 口服糖耐量(OGTT)試驗 皮下注射8周后，18：00開始禁食，次日晨8：00，尾靜脈采血1～2 mL，3000 r/min離心10 min收集血清，-20℃凍存，以放射免疫法測空腹胰島素。利用羅氏血糖儀測血糖值。HOMA-IR=FINS*FPG/22.5。

1.5 卵巢形態(tài)學(xué)檢測 大鼠10% 水合氯醛麻醉后處死。切取部分卵巢組織，常規(guī)石蠟包埋、切片以及HE 染色。

2 結(jié)果

2.1 2組大鼠體重、卵巢質(zhì)量、卵巢體積比較 模型組大鼠體重較對照組明顯加重(P<0.05)，模型組卵巢重量及卵巢體積均顯著高于對照組(P<0.05)(見表1)。

表1 對照組與模型組大鼠體重、卵巢重量、卵巢體積比較

2.2 2組大鼠血清性激素及胰島素抵抗的評估 模型組大鼠血清LH、LH/FSH、T、FINS、，HOMA-IR水平均顯著高于對照組(P<0.05)，模型組大鼠血清E2，F(xiàn)SH，F(xiàn)BG水平與對照組無顯著性差異(P>0.05)。

表2 2組性激素及胰島素抵抗情況比較

2.3 卵巢光鏡HE 染色觀察 模型組大鼠卵巢白膜下見多個呈囊性擴張的卵泡，其卵泡內(nèi)卵母細胞或放射冠消失，黃體細胞少見，顆粒細胞層減少至2～3層；對照組大鼠卵巢顆粒細胞呈多層，多為8～9層并可見多個黃體。(見圖1)

A.對照組卵巢HE染色(×40)

B.模型組卵巢HE染色(×40)

3 討論

目前，國內(nèi)外針對PCOS已建立了多種造模方法，有雄激素造模法、雌激素造模法、孕激素聯(lián)合HCG造模法、胰島素聯(lián)合HCG造模法、芳香化酶抑制劑造模法等，但這些造模方法都還不成熟完善，無法完全模擬臨床上PCOS患者發(fā)病，研究認為臨床上大部分PCOS患者尤其是具有IR和高胰島素血癥者，常伴有體質(zhì)量的增加和脂肪代謝的紊亂[2-4]。

高脂飲食可能是女性多囊卵巢的發(fā)病誘因之一[5]，高脂飲食可誘導(dǎo)出IR，其機制可涉及胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的多個環(huán)節(jié)，如胰島素受體、胰島素受體底物蛋白表達及磷酸化的減少，PI3K及PKB活性的改變等[6]，但一些研究認為單獨應(yīng)用高脂飼料構(gòu)建的PCOS 模型在性激素及卵巢形態(tài)改變方面不典型，因此需與激素誘導(dǎo)法聯(lián)合應(yīng)用。丙酸睪丸酮是目前常用來PCOS造模的藥物，桂文武等發(fā)現(xiàn)丙酸睪酮造模法，可使卵巢均呈多囊改變，睪酮、空腹血糖和空腹胰島素水平升高[7]，為了使模型盡量符合人類PCOS的特點，本研究通過丙酸睪丸酮結(jié)合高脂飲食造模旨在更能使模型體現(xiàn)PCOS的高雄及高胰島素的特征。

結(jié)果顯示，丙酸睪丸酮結(jié)合高脂飲食造模組大鼠的卵巢出現(xiàn)了多囊卵巢的病理改變，表現(xiàn)為卵巢表面蒼白，卵巢內(nèi)黃體少見，卵泡多呈囊性擴張，除了卵巢形態(tài)學(xué)的改變，丙酸睪丸酮結(jié)合高脂飲食模型組大鼠具備PCOS典型的生理病理特征雄激素水平升高、LH/FSH比值升高，空腹胰島素升高及其HOMA-IR顯著高于對照組。說明此動物模型在卵巢形態(tài)學(xué)和性激素分泌異常方面與PCOS患者類似，在糖代謝方面也與PCOS患者相似，因此，丙酸睪丸酮結(jié)合高脂飲食誘導(dǎo)的PCOS動物模型對于研究PCOS合并胰島素抵抗的發(fā)生機制為一種理想的動物模型。

參考文獻：

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[4]Olszanecka-GlinianowiczM，BanasM，Zahorska-Markiewicz Z，et al.Insulin resistance and serum concentrations of ovarian and adrenal androgen in obese women without additional disease and with polycystic ovary syndrome[J].Endokrynol Pol，2005，56(6)：921-926.

[5]倪倩倩，朱夢嬌，姚根宏，等.高脂肪飲食誘導(dǎo)多囊卵巢綜合征表型改變的實驗研究[J]，醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2014，27(2)：116-119.

[6]Youngren JF，Paik J，Barnard RJ.Impaired insulin-receptor autophosphorylation is an early defect in fat-fed，insulin resistant rats[J].J Appl Physiol，2001，91(5)：2240-2247.

[7]桂文武，陳靜，丘彥，等.類多囊卵巢綜合征大鼠模型的比較研究[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2006，16(6)：330-332.