張海龍,張俊英,晉學(xué)英,牛敬憲,黎珍娟,張鳳蘭

(涉縣中醫(yī)院 1外科， 2針灸推拿科， 3婦產(chǎn)科， 4內(nèi)科， 5皮膚科， 6檢驗(yàn)科, 河北 涉縣 056400)

免疫調(diào)控平衡對維持機(jī)體正常生命活動及預(yù)防自身免疫疾病具有重要的意義。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Treg)是一類控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的細(xì)胞群，具有減輕機(jī)體炎癥損傷，控制免疫應(yīng)答效應(yīng)的作用[1]。Th17是近年發(fā)現(xiàn)可分泌白細(xì)胞介素(interleukin,IL)17輔助T細(xì)胞，而IL-17可誘導(dǎo)機(jī)體組織損傷及引發(fā)炎性反應(yīng)[2]。目前已有發(fā)現(xiàn)多種自身免疫疾病的發(fā)生與Th17細(xì)胞調(diào)節(jié)失衡有關(guān)。Th1輔助細(xì)胞具有抵抗機(jī)體免疫反應(yīng)的作用，其主要為IL-12誘導(dǎo)產(chǎn)生[3]。強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一種累及脊柱及骶髂關(guān)節(jié)的系統(tǒng)性、慢性炎癥疾病[4]。目前不少研究表明免疫細(xì)胞調(diào)控失衡與AS發(fā)病及病情進(jìn)展具有密切的關(guān)系[5]。本研究將通過測定Th1、Th17、Treg細(xì)胞比率及其相關(guān)炎癥因子水平，探討AS患者外周血Th1/Th17/Treg細(xì)胞失衡情況及其與強(qiáng)直性脊柱炎疾病活動評分(ankylosing spondylitis disease activity score,ASDAS)的關(guān)系，旨在為AS臨床防治提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2012年1月至2014年1月涉縣中醫(yī)院風(fēng)濕骨病科收治的60例AS患者(AS組)為研究對象。其中男48例、女12例，年齡18～62(39.0±3.2)歲，病程1～12(4.8±1.2)年。參照國際強(qiáng)直性脊柱炎協(xié)會(ASAS)2009年制訂的ASDAS診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]將AS患者分為病情穩(wěn)定(ASDAS<1.3)14例，病情中度活動(1.3≤ASDAS<2.1)28例，重度(ASDAS≥2.1)18例。另選取同期在本院行正常體檢者60例為對照組，男48例、女12例，年齡20～62(39.2±3.1)歲，均不符合AS診斷標(biāo)準(zhǔn)，其余排除標(biāo)準(zhǔn)與AS組相同。兩組性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn) ①均符合1984年修訂AS紐約標(biāo)準(zhǔn)[6]；②所有受試者均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌疾病、多發(fā)性硬化疾病者；②近3個(gè)月內(nèi)應(yīng)用過激素或免疫抑制劑者；③查體時(shí)發(fā)現(xiàn)心肺、內(nèi)分泌系統(tǒng)感染者；④活動性肺結(jié)核、惡性腫瘤、炎性腸病者。

1.3方法

1.3.1血液樣本制備 AS組與對照組于清晨8:00～9:00點(diǎn)空腹抽取靜脈血5 mL，加入肝素鈉抗凝，置于離心機(jī)中以離心半徑15 cm, 3000 r/min離心10 min后，棄去上清液，并置于-80 ℃中待測。

1.3.2Th1、Th17、Treg細(xì)胞比率的測定 取上述樣品于常溫下復(fù)溫后，加入淋巴細(xì)胞分離液(北京寶來生物科技公司)，應(yīng)用密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞，采用RPM1640將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×106mL-1，將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期的細(xì)胞于測定管中，分別加入鼠抗人CD8單抗(美國Sigma公司)及鼠抗人CD3單抗(美國Sigma公司)，與4 ℃避光反應(yīng)20 min，采用固定液于室溫下固定15 min后離心處理10 min棄去上清液，磷酸鹽緩沖液洗滌2次后，分別加入IL-17A-FTTC(澳大利亞eBioscience公司)及IFN-γ-FTTC(澳大利亞eBioscience公司)進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)染色。染色后采用美國貝克曼公司提供的Beckm Epics流式細(xì)胞儀測定外周血CD4+Th17、CD4+Th1及CD4+CD25+Treg細(xì)胞比率。

1.3.3炎性因子水平測定 采用酶聯(lián)免疫法測定兩組血清IL-6、IL-8、IL-17、IL-23及TNF-α水平，各血清細(xì)胞因子試劑盒均由北京中杉金橋生物有限公司提供，操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1兩組外周血CD4+Th17、CD4+Th1及CD4+CD25+Treg細(xì)胞比率 AS組患者CD4+Th17細(xì)胞水平高于對照組，而CD4+Th1及CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 兩組外周血CD4+ Th17、CD4+ Th1及 CD4+CD25+ Treg細(xì)胞比率 %)

AS組：強(qiáng)直性脊柱炎；對照組：正常體檢者

2.2兩組炎性因子水平分析 AS組IL-6、 IL-17、IL-23及TNF-α蛋白水平顯著高于對照組(P<0.05)(表2)。

表2 兩組炎性因子水平分析

組別例數(shù)IL-6IL-8IL-17IL-23TNF-αAS組6011.36±1.635.58±1.2637.58±5.12514.23±42.1238.12±4.62對照組603.75±1.215.96±2.368.96±0.89186.32±34.567.89±2.45t5.1690.4859.15812.9638.125P0.0000.1100.0000.0000.000

AS組：強(qiáng)直性脊柱炎；對照組：正常體檢者

2.3不同ASDAS患者外周血CD4+Th17、CD4+Th1及CD4+CD25+Treg細(xì)胞比率 與病情穩(wěn)定、中度活動患者相比，重度患者CD4+Th17細(xì)胞水平顯著升高，而CD4+Th1、CD4+CD25+Treg細(xì)胞顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

表3 兩組外周血CD4+ Th17、CD4+ Th1及 CD4+CD25+Treg細(xì)胞比率 %)

a：與穩(wěn)定相比，P<0.05；b：與中度活動相比，P<0.05

2.4不同ASDAS患者炎性因子水平分析 與病情穩(wěn)定、中度活動的患者相比，重度患者的IL-6、 IL-17、 IL-23及TNF-α蛋白水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表4)。

表4 不同ASDAS患者炎性因子水平分析

病情例數(shù)IL-6IL-8IL-17IL-23TNF-α穩(wěn)定 145.36±1.488.12±2.1414.85±1.12242.36±51.4811.28±3.14中度活動289.68±2.52a8.39±2.2825.98±3.48a386.12±95.23a30.98±4.98a重度 1814.26±3.89ab8.37±2.98 42.69±4.63ab598.36±101.45ab43.12±5.13abF8.7960.44214.26925.6929.526P0.0000.1250.0000.0000.000

a：與穩(wěn)定相比，P<0.05；b：與中度活動相比，P<0.05

2.5炎性因子水平與ASDAS的關(guān)系 經(jīng)Pearson相關(guān)分析可知，ASDAS與IL-6(r=0.412，P=0.000)、IL-17(r=0.396，P=0.000)、IL-23(r=0.384，P=0.000)及TNF-α(r=0.318，P=0.004)呈正相關(guān)，而與IL-8無相關(guān)(r=-0.146，P=0.128)。

3 討 論

研究表明AS的發(fā)生與T細(xì)胞亞群比例失調(diào)具有密切的關(guān)系，其發(fā)病過程與T細(xì)胞亞群功能異常及其下游Th17/IL-23被激活和未折疊的蛋白免疫應(yīng)答反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)[8]。CD4+T是機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)中的主要部位，根據(jù)CD4+T細(xì)胞分化功能性可分為Th1、Th2、Th17、Treg等亞群，在正常情況下這些Th細(xì)胞亞群彼此間相互聯(lián)系、相互牽制，處于動態(tài)平衡，但當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染、慢性炎癥損傷或遺傳異常時(shí)，這些T細(xì)胞亞群彼此間的平衡將被打破，從而導(dǎo)致機(jī)體免疫調(diào)控失衡，引起自身免疫性疾病。

Treg是一類控制體內(nèi)自身免疫反應(yīng)性的細(xì)胞群,其具有抑制T細(xì)胞增殖及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力的作用[9]。Zhao等[10]通過體外動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞可通過抑制Th17細(xì)胞分化或下調(diào)IL-17, IL-23表達(dá)來抑制Th17細(xì)胞增生。Xueyi等[11]對應(yīng)用Th17受體拮抗劑治療的小鼠敲除或阻斷Th17受體阻斷后能有效抑制骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，減少骨組織及關(guān)節(jié)組織損傷。本研究結(jié)果顯示，AS組患者CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平低于對照組，且隨著ASDAS的增加，其水平顯著下降(P<0.05)，而AS組患者CD4+Th17細(xì)胞水平顯著高于對照組，

且隨著ASDAS的增加，其水平顯著升高。這提示在AS患者中外周血Treg水平受到抑制，而Th17細(xì)胞則處于活躍狀態(tài)，Treg/Th17免疫格局偏向Th17，從而可以推測AS患者機(jī)體內(nèi)免疫調(diào)控機(jī)制紊亂與Treg細(xì)胞數(shù)量減少導(dǎo)致Treg/Th17免疫格局失衡有關(guān)。

Th1細(xì)胞與Th17細(xì)胞均源于CD4+T細(xì)胞，初始CD4+T細(xì)胞在干擾素γ、IL-2等細(xì)胞因子的介導(dǎo)下可分化為Th1細(xì)胞，在IL-1、 IL-6、轉(zhuǎn)化生長因子β介導(dǎo)下則可分化為Th17細(xì)胞[12]。Chen等[13]研究指出，Th1細(xì)胞與Th17細(xì)胞可相互拮抗，Th1在特異情況下可轉(zhuǎn)化為Th17,而Th17在特殊情況下也可轉(zhuǎn)化為Th1。本研究結(jié)果顯示，AS組患者CD4+Th17的比率顯著高于對照組，而CD4+Th1比率低于對照組，且隨著ASDAS的增加，CD4+Th17水平顯著升高，而CD4+Th1水平顯著下降，從而表明AS患者體內(nèi)存在Th17與Th1相互拮抗的現(xiàn)象，且CD4+Th1水平低下可介導(dǎo)細(xì)胞功能低下。

IL-6、 IL-17、 IL-23及TNFα是由Th17分泌的促炎因子，這些炎性因子可激活機(jī)體T細(xì)胞及其他相關(guān)免疫細(xì)胞大量生成細(xì)胞黏附因子、化學(xué)增活素及自由基等，從而進(jìn)一步加劇機(jī)體炎性反應(yīng)，引起機(jī)體炎癥損傷[14]。本研究結(jié)果顯示，AS組IL-6、IL-17、IL-23及TNFα蛋白水平顯著高于對照組(P<0.05)，且隨著ASDAS的增加，AS組IL-6、IL-17、IL-23及TNFα蛋白水平顯著升高，與ASDAS呈正相關(guān)，從而表明AS的發(fā)生與免疫失調(diào)引起的促炎因子大量釋放及抑制炎性因子分泌不足有關(guān)。

綜上所述，AS患者中存在Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞及Treg細(xì)胞免疫平衡失調(diào)，且與AS患者ASDAS程度具有密切的關(guān)系。通過測定AS患者相關(guān)炎性因子水平對預(yù)測患者病情進(jìn)展具有重要的意義。

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