王文鋒

(商洛市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西 商洛 726000)

甲狀腺激素與人體的生長發(fā)育和代謝密切相關(guān)。各種原因?qū)е录谞钕偌に剡^多的釋放入血，可對心血管系統(tǒng)造成損害。其基本機制是交感神經(jīng)活性增強與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin angiotensin aldosterone system，RAAS)的啟動[1-3]。堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是人體正常組織器官中具有多種生物學(xué)功能的多肽生長因子，主要刺激多種間質(zhì)來源和神經(jīng)外胚層來源細胞的分化增殖和趨化，病理情況下也可由血管平滑肌細胞及粥樣斑塊中的壞死細胞產(chǎn)生,參與心肌缺血和梗死后的組織修復(fù)，在心血管疾病的病理生理過程中發(fā)揮重大的作用[4-5]。本研究通過測定甲狀腺毒癥大鼠心肌bFGF水平變化，探討其在甲狀腺毒癥心血管損害中的作用。

1 材料與方法

1.1動物分組及模型制備 45只成年雄性SD大鼠(購自西安交通大學(xué)動物實驗中心)，無特定病原體級別，體質(zhì)量260～330 g，于室溫(21±3) ℃、相對濕度(55±5)%條件下顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后按完全隨機法分為兩組：對照組22只，給予生理鹽水5 mL/kg灌胃；甲狀腺毒癥模型組23只，給予左旋甲狀腺素鈉0.5 mg/kg灌胃。對照組體質(zhì)量(274±30) g，甲狀腺毒癥模型組體質(zhì)量(278±20) g,兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。每日灌胃1次，4周后用3%戊巴比妥鈉按照10 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)腹主動脈抽血5～6 mL，在4℃低溫以1350×g，3000 r/min、離心10 min，汲取上層血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要實驗試劑和設(shè)備 左旋甲狀腺素鈉：Merk KgaA,Germany；放射免疫固相微球分離三碘甲狀腺原氨酸總量(total tri-iodothyronine,TT3)、甲狀腺素總量(total thyroxine,TT4)試劑盒：貨號 IMK439/IMK440,北京原子股份有限公司生產(chǎn)；促甲狀腺素(thyroid-stimulting hormone，TSH)免疫放射分析試劑盒：天津市協(xié)和科技有限公司生產(chǎn)；bFGF一抗：兔抗鼠-rat bFGF，北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；親和純化抗體(羊抗兔)，標(biāo)記長臂生物素，效價1∶100～1∶200；GC400γ放射免疫計數(shù)器：合肥科大創(chuàng)新生產(chǎn)。

1.3血清TT3、TT4、TSH的測定 TT3、TT4放射免疫試劑盒(固相微球分離法)中自帶空白對照管、標(biāo)準(zhǔn)管及樣品管，空白對照管中加入125I-T3/125I-T4200 μL，標(biāo)準(zhǔn)管中依次加入濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)液50 μL、125I-T3/125I-T4200 μL、T3/T4微球抗體 200 μL，樣品管依次加入血清樣品50 μL 、125I-T3/125I-T4200 μL、T3/T4微球抗體200 μL，經(jīng)溫育、低溫離心后棄去上清，置于GC400γ放射免疫計數(shù)儀中測定沉淀放射性計數(shù)60 s，預(yù)設(shè)為四參數(shù)方程曲線擬合方式，依據(jù)各管放射性計數(shù)計算出放射性碘的結(jié)合率，所以測得的結(jié)合率與樣品TT3或TT4的水平呈負相關(guān)，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與結(jié)合率的關(guān)系按照四參數(shù)方程曲線擬合方式求得待測樣品的濃度。

采用TSH免疫放射分析試劑盒(一步夾心法)測定大鼠TSH，用單抗固相包被管預(yù)設(shè)質(zhì)控管、濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)管及樣品管。質(zhì)控管及樣品管中加入質(zhì)控液或血清200 μL、125I-TSH單抗50 μL，各標(biāo)準(zhǔn)管中依次加入濃度梯度的TSH標(biāo)準(zhǔn)品200 μL、125I-TSH 單抗50 μL，經(jīng)震蕩、洗滌后傾倒液體并吸干剩余水分，按照與測定TT3和TT4相似的方法求得血清樣品中TSH的濃度。

1.4心/體質(zhì)量比測量 抽血后于大鼠左心室內(nèi)注射1.34 mol/L氯化鉀使心臟停搏，取出心臟，沿動靜脈根部剪去殘余血管，生理鹽水沖洗干凈后用清潔濾紙吸干水分，稱量心臟濕重，計算心臟與體質(zhì)量比，用心臟的毫克數(shù)與體質(zhì)量的百克數(shù)計算結(jié)果作為比值。

1.5心肌細胞直徑、膠原容積測定 剪取心臟左心室組織50～60 mg，置入10%甲醛固定24 h，經(jīng)過渡、脫水、透明、浸蠟包埋后切片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色及Masson染色。使用CMIS-B型細胞醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測量心肌細胞橫切面跨核處最長直徑，單位為“μm”。每個視野下隨機測量10個細胞，每個標(biāo)本隨機移動5個區(qū)域測量，求平均值。采集Masson染色圖像，分別測量膠原纖維面積及視野總面積，計算比值作為心肌膠原容積，膠原容積=每一視野膠原纖維面積/每一視野總面積，每個標(biāo)本隨機采集3個不同區(qū)域的圖像，求其平均值[6-7]。

1.6心肌bFGF測定 心肌石蠟切片進行免疫組織化學(xué)染色，采用鏈霉親和素-生物素-辣根過氧化物酶物法。經(jīng)常規(guī)脫蠟水化、修復(fù)、封閉、一抗孵育、二抗孵育，滴加鏈霉親和素-生物素-辣根過氧化物酶復(fù)合物，靜置、洗滌、顯色、復(fù)染后做脫水、透明處理，風(fēng)裱劑封片。用CMIS-B型細胞醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)400×鏡下隨機截取免疫組織化學(xué)切片圖像，每標(biāo)本隨機選10個位點測量陽性反應(yīng)產(chǎn)物面積，然后取平均值。應(yīng)用圖像處理系統(tǒng)測定陽性產(chǎn)物灰度表示陽性產(chǎn)物強度，灰度數(shù)值愈大(灰度層次愈小)則陽性反應(yīng)物的反應(yīng)強度愈小。背景灰度測量值-陽性物灰度測量值作為陽性強度灰度值，陽性反應(yīng)面積/測量面積×陽性強度灰度值作為bFGF陽性指數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1兩組大鼠一般情況比較 灌胃1周后甲狀腺毒癥模型組大鼠容易激惹，進食及飲水顯著增加，伴有明顯的肌肉震顫、稀便及排便次數(shù)增加。4周后甲狀腺毒癥模型組大鼠脈率(414±25)次/min，較對照組(366±23)次/min升高(t=6.6，P<0.01)，收縮壓(139±4) mmHg，較對照組(121±7) mmHg升高(t=10.2,P<0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2兩組大鼠血清TT3、TT4、TSH水平比較 甲狀腺毒癥模型組大鼠血清TT3、TT4水平較對照組顯著升高；甲狀腺毒癥模型組大鼠血清TSH較對照組顯著降低(表1)。

表1 兩組大鼠血清TT3、TT4、TSH水平比較

組別只數(shù)TT3(mmol/L)TT4(mmol/L)TSH(mU/L)對照組 220.6±0.14.5±1.00.12±0.02甲狀腺毒癥模型組230.8±0.118.2±2.5 0.09±0.01t5.024.16.0P<0.01 <0.01 <0.01

TT3:三碘甲狀腺原氨酸總量; TT4:甲狀腺素總量; TSH:促甲狀腺素

2.3心/體質(zhì)量比、心肌細胞直徑、心肌膠原容積及心肌bFGF陽性指數(shù)比較 甲狀腺毒癥模型組心/體質(zhì)量比較對照組顯著增加；心肌細胞直徑、心肌細胞膠原容積及bFGF陽性指數(shù)較對照組顯著增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(表2)。

表2 兩組心/體質(zhì)量比、心肌細胞直徑、膠原容積及bFGF陽性指數(shù)比較

組別只數(shù)心/體質(zhì)量比心肌細胞直徑(μm)心肌膠原容積(%)bFGF陽性指數(shù)對照組 22260±3211.7±1.53.0±1.15.6±1.1甲狀腺毒癥模型組23335±21 15.0±1.6 8.9±0.7 18.3±1.4 t9.127.120.533.4P<0.01 <0.01 <0.01 <0.01

bFGF: 堿性成纖維細胞生長因子

3 討 論

心肌重構(gòu)是心臟對體內(nèi)外環(huán)境變化的適應(yīng)性反應(yīng)，包括功能重構(gòu)(早期重構(gòu))和結(jié)構(gòu)重構(gòu)(晚期重構(gòu))，與各種神經(jīng)內(nèi)分泌機制激活有關(guān)，主要是交感系統(tǒng)與RAAS激活。甲狀腺毒癥引起的心肌重構(gòu)與交感神經(jīng)興奮性增加的關(guān)系已毋庸置疑，主要涉及早期的功能重構(gòu)，表現(xiàn)為快速性心律失常及外周循環(huán)的高動力狀態(tài)，而在甲狀腺毒癥心肌損害的晚期結(jié)構(gòu)改變及心力衰竭與心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展中可能與RAAS機制關(guān)系密切。

本實驗給予甲狀腺激素灌胃4周后，大鼠的心肌細胞直徑及膠原容積顯著增加，心肌細胞增粗，免疫組織化學(xué)見bFGF呈強陽性表達，對照組少有bFGF表達。這一結(jié)果說明甲狀腺毒癥大鼠心肌肥厚隨著bFGF表達的增高而增加，而bFGF可能是甲狀腺毒癥心肌肥厚的機制之一。何作云等[6]研究表明，二尖瓣關(guān)閉不全伴狹窄的壓力超負荷左心室肥大病，以及先天性心臟病(法洛氏四聯(lián)征或三聯(lián)征)患者容量超負荷的右心室肥大患者，其肥大心肌細胞中bFGF和轉(zhuǎn)化生長因子的信使RNA表達及其蛋白水平均顯著增加，證明bFGF可以在壓力超負荷及容量超負荷時表達增加，參與心肌肥厚的形成。目前已經(jīng)明確的bFGF表達增加的機制有：①外周血流量增加，血流加速，形成湍流，使血管壁內(nèi)皮細胞受到的剪切力增加，一氧化氮的表達增加，誘導(dǎo)內(nèi)生性bFGF；②心率加快、循環(huán)血量增多、壓力負荷增加等血流動力學(xué)改變與心率依賴性的機械生長因子表達增加可以介導(dǎo)心肌bFGF表達增加；③壓力超負荷及容量超負荷，引起RAAS機制激活，并上調(diào)心肌血管緊張素1受體的表達，誘導(dǎo)心肌細胞原癌基因C-myc信使RNA的過度表達，也可以增加bFGF的表達[9-11]。bFGF以自分泌及旁分泌方式，亦可通過胞內(nèi)分泌的方式——核轉(zhuǎn)位機制直接發(fā)揮其基因調(diào)控作用。bFGF可以促進血管平滑肌細胞分化增殖與尿激酶型纖溶酶原激活物的表達上調(diào)，促進心肌肥厚的發(fā)展[12-13]。

綜上所述，甲狀腺毒癥心肌肥厚與bFGF的關(guān)系可以概括為交感激活，容量和(或)壓力超負荷，RAAS啟動，bFGF表達增加，促進心肌細胞肥大與膠原纖維增生，導(dǎo)致心肌肥厚。這一發(fā)現(xiàn)可以進一步明確甲狀腺毒癥交感及RAAS激活導(dǎo)致心肌肥厚的機制，為甲狀腺毒癥心肌損害研究提供新的思路，提示甲狀腺毒癥早期改善血流動力學(xué)的抗交感及抗RAAS治療相當(dāng)重要，如有可能，阻斷bFGF亦可為甲狀腺毒癥乃至其他原因引起心肌重構(gòu)的方法之一。

[1] Honda H,Iwata T,Matsuda H,etal.Comparison of muscarinic receptor-and beta-adrenoceptor-mediated vasorelaxation between euthyroid and acute hyperthyroid rats[J].Comp Biochem Physiol C Pharmacol Toxicol,2005,141(3):241-247.

[2] Patan S,Marte F.Atrial fibrillation associated with exogenous subclinical hyperthyroidism,changing axis deviation,troponin-I positive and without acute coronary syndrome[J].Int J Cardiol,2011,150(3):e85-e88.

[3] Fommei E.Iervasi G.The role of thyroid hormone in blood pressure homeostasis:evidence from short-term hypothyroidism in humans[J].J Clin Endocrinol Metab,2002,87(5):1996-2000.

[4] 胡丙杰,陳建國,徐小虎,等.早期心肌梗死bFGF的免疫組化研究[J].法醫(yī)學(xué)雜志,2000,16(4):205-207.

[5] 崔建奇,柳川，周延沖,等.成纖維細胞生長因子與心血管疾病[J].生理科學(xué)進展,1994,25(1):76-79.

[6] Carneiro-Ramos M,Diniz GP,Nadu AP,etal.Blockage of Angiotensin II type 2 receptor prevents thyroxine-mediated cardiac hypertrophy by blocking Akt activation[J].Basic Res Cardiol,2010,105(3):325-335.

[7] Rentzsch B,Todiras M,Iliescu R,etal.Transgenic angiotensin-converting enzyme 2 overexpression in vessels of SHRSP rats reduces blood pressure and improves endothelial function[J].Hypertension,2008,52(5):967-973.

[8] 何作云,羅惠蘭,馮兵,等.血液動力學(xué)超負荷患者心肌肥大時bFGF,TGF-β1的變化[J].中國病理生理雜志,2000,16(10):994-995.

[9] Sah RL,Chen AC,Grodzinsky AJ,etal.Differential effects of bFGF and IGF-I on matrix metabolism in calf and adult bovine cartilage explants[J].Arch Biochem Biophys,1994,308(1):137-147.

[10] 張冬,任江華,曹茂銀.容量超負荷心肌肥大時局部心肌AngⅡ,bFGF的變化及ATI受體拮抗劑對其影響的實驗研究[J].心臟雜志,2002, 14(4):296-300.

[11] Fukuyama K,Ichiki T,Takeda K,etal.Downregulation of vascular angiotensin II type 1 receptor by thyroid hormone[J].Hypertension,2003,41(3):598-603.

[12] Ziche M,Parenti A,Ledda F,etal.Nitric oxide promotes proliferation and plasminogen activator production by coronary venular endothelium through endogenous bFGF[J].Circ Res,1997,80(6):845-852.

[13] Axelband F,Dias J,Ferr?o FM,etal.Nongenomic signaling pathways triggered by thyroid hormones and their metabolite 3-iodothyronamine on the cardiovascular system[J].J Cell Physiol,2011,226(1):21-28.