姜辰 韓園 唐娟娟 劉文濤 張廣欽

以嗎啡為代表的阿片類(lèi)藥物具有強(qiáng)效的鎮(zhèn)痛作用，是臨床上治療重度疼痛的重要藥物，但是多次給藥以后，其鎮(zhèn)痛作用極易耐受，這顯著抑制了阿片類(lèi)藥物的有效使用。嗎啡耐受的機(jī)制尚不明確，以往認(rèn)為嗎啡耐受主要是由神經(jīng)元機(jī)制所介導(dǎo)。最近的證據(jù)表明，膠質(zhì)細(xì)胞的活化，尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，在嗎啡的耐受過(guò)程中同樣起著重要作用?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞分泌大量炎癥因子，如白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)，敏化脊髓背角的神經(jīng)元進(jìn)而大大減弱了嗎啡的鎮(zhèn)痛作用[1,2]。

核因子κB(NF-κB)廣泛存在于真核細(xì)胞，是一多功能的核轉(zhuǎn)錄因子，它參與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞的增殖與凋亡[3]。NF-κB核轉(zhuǎn)位后，會(huì)促進(jìn)免疫細(xì)胞炎癥因子生成增多。吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)是一種抗氧化劑，它是NF-κB特異性的抑制劑，主要通過(guò)抑制NF-κB P65亞單位，或抑制IκB的降解，減少NF-κB的核移位來(lái)抑制NF-κB的活性。

最近有文獻(xiàn)報(bào)道，嗎啡耐受模型中，脊髓背角中的小膠作者單位：211198 中國(guó)藥科大學(xué)臨床藥學(xué)教研室(姜辰 張廣欽)；徐州醫(yī)學(xué)院，江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(韓園)；南京中醫(yī)藥大學(xué)，生理學(xué)教研室(唐娟娟);南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇省神經(jīng)退行性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(劉文濤)

質(zhì)細(xì)胞伴隨著NF-κB核轉(zhuǎn)位的增多現(xiàn)象，提示小膠質(zhì)細(xì)胞中的NF-κB可能參與嗎啡耐受進(jìn)程。但是抑制NF-κB能否減輕嗎啡導(dǎo)致的小膠質(zhì)細(xì)胞活化缺少直接證據(jù)。作者應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)嗎啡對(duì)BV-2細(xì)胞前炎癥因子mRNA水平的影響，并給予NF-κB特異性的抑制劑-PDTC進(jìn)行干預(yù)，考察PDTC對(duì)嗎啡引起B(yǎng)V-2細(xì)胞炎癥因子合成的影響。

1 材料

1.1藥物 嗎啡，沈陽(yáng)第一制藥廠，東北制藥集團(tuán)公司(中國(guó))。PDTC，sigma(美國(guó))。

1.2細(xì)胞BV-2小鼠源小膠質(zhì)細(xì)胞，購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院。

1.3儀器 7300 Real-time PCR 系統(tǒng)(Applied Biosystems, Warrington, 英國(guó))。

2 方法與結(jié)果

2.2細(xì)胞培養(yǎng) BV-2細(xì)胞在5%CO2和95%O237℃潮濕環(huán)境含10%胎牛血清(Hyclone, USA)和1%青鏈霉素(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)的培養(yǎng)基(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前24 h，將培養(yǎng)基換成0.5%胎牛血清高糖DMEM。

2.3PDTC對(duì)嗎啡誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞炎癥因子釋放的影響 實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)mRNA水平。具體方法如下：BV-2細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、嗎啡模型組、嗎啡PDTC治療組和PDTC組。模型組嗎啡200μM培養(yǎng)6 h；PDTC治療組采用PDTC 30μM在嗎啡前30 min預(yù)給藥，與嗎啡共培養(yǎng)6 h；PDTC組給予PDTC 30μM培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)的細(xì)胞應(yīng)用Trizol法抽提各組細(xì)胞RNA，Real-time PCR應(yīng)用7300 Real-time PCR 系統(tǒng)。表1中列出特異性IL-1β、IL-6、TNF-α和GAPDH引物序列。實(shí)時(shí)PCR實(shí)驗(yàn)方案如下：95℃ 10 min，40個(gè)循環(huán)：60℃ 60s，95℃ 15 s，溶解曲線60～90℃保證擴(kuò)增為單一產(chǎn)物。以Ct值進(jìn)行結(jié)果分析，采用相對(duì)量法與內(nèi)參GAPDH比較。計(jì)算公式為：2-ΔCT, Δ Ct=Ct gene-Ct control。

表1 IL-1β、IL-6、TNF-α和GAPDH mRNA實(shí)時(shí)PCR引物序列

結(jié)果可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，BV-2細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平均可被嗎啡處理誘導(dǎo)升高(P< 0.01，見(jiàn)圖1、圖2、圖3)，PDTC顯著抑制了這一升高(P< 0.05，見(jiàn)圖1、圖2、圖3)，并且PDTC基礎(chǔ)給藥不影響B(tài)V-2細(xì)胞炎癥因子mRNA水平(P> 0.05，見(jiàn)圖1、圖2、圖3)。結(jié)果表明，PDTC能抑制嗎啡誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的合成。

注：***P<0.01與未處理對(duì)照組比較，#P< 0.05與嗎啡造模組比較

注：**P<0.01與未處理對(duì)照組比較，#P< 0.05與嗎啡造模組比較

注：**P<0.01與未處理對(duì)照組比較，##P<0.01與嗎啡造模組比較

3 討論

在這篇研究中，作者發(fā)現(xiàn)嗎啡可以在體外直接導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞系BV-2細(xì)胞的IL-1β、IL-6和TNF-α合成增多，并且PDTC可以顯著抑制嗎啡導(dǎo)致炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α合成增多。

脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化在嗎啡耐受的發(fā)展中起著重要作用。嗎啡處理能誘導(dǎo)脊髓小膠質(zhì)的顯著活化，強(qiáng)烈活化的小膠質(zhì)細(xì)胞能分泌大量促炎癥細(xì)胞因子和炎癥趨化因子，例如IL-1β、IL-6和TNF-α，這些最終調(diào)節(jié)脊髓突觸傳遞，導(dǎo)致背角神經(jīng)元興奮性的增加；另一方面，神經(jīng)元的興奮性增高，可以通過(guò)釋放NO、興奮性氨基酸，如谷氨酸等，進(jìn)一步活化周?chē)男∧z質(zhì)和星形膠質(zhì)細(xì)胞形成正反饋，進(jìn)而導(dǎo)致強(qiáng)烈持久的神經(jīng)炎癥[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射米諾環(huán)素(小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑)或抑制炎癥細(xì)胞因子的釋放均能顯著抑制嗎啡耐受的發(fā)展，增強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛作用。因此控制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和炎癥因子的生成具有重要意義。

NF-κB是小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[6]。在細(xì)胞應(yīng)激等條件，NF-κB由IKKβ等激活而發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子(尤其是IL-1β)合成。作者首次證實(shí)：NF-κB抑制劑PDTC可顯著減少嗎啡誘導(dǎo)的炎癥因子的生成，這一研究提示：PDTC可能對(duì)于增強(qiáng)嗎啡鎮(zhèn)痛作用具有積極作用，但是關(guān)于PDTC改善嗎啡鎮(zhèn)痛作用的詳細(xì)分子機(jī)制，仍需更深層次的研究和探討。

綜上所述，本文證實(shí)了PDTC能通過(guò)抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位顯著降低嗎啡導(dǎo)致的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子合成。該研究可能為減少阿片類(lèi)藥物的副反應(yīng)，增強(qiáng)鎮(zhèn)痛效果提供新的思路和靶標(biāo)。

[1] F. Ferrini, T. Trang, T.A. Mattioli, et al. Morphine hyperalgesia gated through microglia-mediated disruption of neuronal Cl(-) homeostasis. Nat Neurosci, 2013(16):183-192.

[2] T. Berta, T. Liu, Y.C. Liu, et al. Acute morphine activates satellite glial cells and up-regulates IL-1beta in dorsal root ganglia in mice via matrix metalloprotease-9. Mol Pain, 2012(8):18.

[3] Aggarwal BB. Nuclear factor-kappaB: the enemy within. Cancer Cell, 2004(6):203-208.

[4] Shavit Y, Wolf G, Goshen I, et al. Interleukin-1 antagonizes morphine analgesia and underlies morphine tolerance. Pain, 2005(115): 50-59.

[5] Sun J, Liu S, Mata M, et al. Transgene-mediated expression of tumor necrosis factor soluble receptor attenuates morphine tolerance in rats. Gene therapy, 2012(19):101-108.

[6] Rius J, Guma M, Schachtrup C, et al. NF-kappaB links innate immunity to the hypoxic response through transcriptional regulation of HIF-1alpha. Nature, 2008(453):807-811.